氨基酸药物的发酵生产.ppt

《氨基酸药物的发酵生产.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氨基酸药物的发酵生产.ppt（84页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第一节 氨基酸类药物的基本概念 一、氨基酸类药物的基本知识 从各种生物体中发现的氨基酸已有180多种，但是参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有二十种。1986年发现第21种 硒代胱氨酸 最近发现第22种遗传基因编码的氨基酸 吡咯赖氨酸。 180多种天然氨基酸大多数是不参与蛋白质组成的，这些氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。 氨基酸是构成机体蛋白质的基本单位，且构成生物体蛋白质的氨基酸都是-氨基酸，除甘氨酸外，-碳原子均为不对称碳原子，具有立体异构现象，均是L-型氨基酸。,1、分类： （1）根据氨基酸在pH5.5溶液中带电状况分为酸性、中性及碱性氨基酸三类。 （2）依R基团差异亦分为： 脂肪族

2、氨基酸、芳香族氨基酸及杂环氨基酸三类 其中L-组氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸及L-羟脯氨酸为杂环氨基酸， L-酪氨酸及L-苯丙氨酸为芳香族氨基酸， 其余均为脂肪族氨基酸。,2、性质： （1）物理通性： 天然氨基酸纯品均为白色结晶性粉末，熔点及分解点均在200以上。 在有机溶剂中溶解度一般较小。 均为两性电解质，各有一定等电点。除甘氨酸外都有旋光性。 氨基酸能使水的介电常数增高,而一般的有机化合物乙醇、丙酮等却使水的介电常数降低。是以离子晶格组成，而一般的有机化合物是由分子晶格组成的。,（2）化学通性： -氨基酸共同的化学反应有两性解离及林海定反应(ninhyding reactiong) 、酰

3、化、烷基化、酯化、酰氯化、酰胺化、叠氮化、脱羧及脱氨反应、肽键结合反应及与甲醛和亚硝酸的反应等。 特殊基团反应： 酪氨酸的酚羟基可产生米伦反应与福林达尼斯反应； 精氨酸的胍基产生坂口反应；,色氨酸的吲哚基与芳醛产生红色反应； 组氨酸的咪唑基产生Pauly反应； 苯丙氨酸硝化后于碱性条件下产生桔黄色反应； 胱氨酸及半胱氨酸经酸或碱破坏后可与醋酸铅产生铅黑反应； 半胱氨酸在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠（硝普盐）反应生成紫红色化合物。 色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸均有特征紫外吸收光谱，色氨酸最大吸收波长为279nrn，苯丙氨酸为259nm，酪氨酸为278nm。但构成天然蛋白质的20种氨基酸在可见光区均无吸

4、收。,氨基酸的上述理化性质是蛋白质与氨基酸合成、转化、分离纯化及定性定量检测的依据 二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用 1、氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，故生物体中众多蛋白质的生物功能，无不与构成蛋白质的氨基酸种类、数量、排列顺序及由其形成的空间构象有密切的关系。因此氨基酸对维持机体蛋白质的动态平衡有极其重要的意义。生命活动中人及动物通过消化道吸收氨基酸 。 通过体内转化而维持其动态平衡，若其动态平衡失调，则机体代谢紊乱，甚至引起病变。,2、许多氨基酸尚有其特定的药理效应。 （）氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系 氨基酸为构成天然蛋白质的基本单位，故蛋白质营养价值实际是氨甚酸作用的反映。

5、健康人靠膳食中的蛋白质获取各种氨基酸满足机体需求。缺乏蛋白质则影响机体生长及正常生理功能，抗病力减弱引起病变。 消化道功能严重障碍者及手术后病人常因禁食无法获得足够蛋白质，自身蛋白质过量消耗，致使营养不良而导致病情恶化或预后不良。,临床上常通过直接输入氨基酸制剂改善患者营养状况，增加治疗机会，促进康复。 赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等8种氨基酸 必需氨基酸：人及哺乳动物自身不能合成，需由食物供应。 半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分别由其他氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)产生，若食物中提供了足够的该氨基酸（氨酸及酪氨酸），可减少对其他氨基酸（蛋氨酸及苯丙

6、氨酸）的需求量。,氨基酸（精氨酸及组氨酸）合成速度较低，通常难以满足需求，需由外界补充一部分。 （二）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物 （三）治疗肝病的氨基酸及其衍生物 （四）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物 （五）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物 （六）其它氨基酸类药物的临床应用,第二节 氨基酸类药物的生产方法 1、 目前全世界天然氨基酸的年总产量在百万吨左右，其中产量较大者有谷氨酸、蛋氨酸及赖氨酸，其次为天门冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它们主要用于医药、食品、饲料及化工行业中。 2、 目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产方法有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成法等四种。 3

7、、 氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐等化学方法或酶转化法生产。,一、水解法 （一）基本原理与过程 以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法。 目前用水解法生产的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。 水解法生产氨基酸的主要过程为水解、分离和结晶精制三个步骤。,1、蛋白质水解方法 目前蛋白质水解分为酸水解法、碱水解法及酶水解法三种。 （1）酸水解法 蛋白质原料用610molL盐酸或8molL硫酸于11012

8、0（回流煮沸）水解1224h，除酸后即得多种氨基酸混合物。此法优点是水解迅速而彻底，产物全部为L-型氨基酸，无消旋作用。缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被破坏，且产生大量废酸污染环境。,（2）碱水解法 蛋白质原料经6molL氢氧化钠或4molL氢氧化钡于100水解6h即得多种氨基酸混合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用。工业上多不采用。 （3）酶水解法 蛋白质原料在一定pH和温度条件下经蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水解法。 此法优点为反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不破坏，无消旋作用。缺点是水解不彻底，产物中除

9、氨基酸外，尚含较多肽类。工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。,2、氨基酸分离方法 氨基酸分离方法较多，通常有溶解度法、等电点沉淀法、特殊试剂沉淀法、吸附法及离子交换法等。 （1）溶解度法 是依据不同氨基酸在水中或其它溶剂中的溶解度差异而进行分离的方法。 胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大，故可将混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分开。 （2）特殊试剂沉淀法 系采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。,如邻二甲苯-4-磺酸能与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，后者与氨水反应又可获得游离亮氨酸； 组氨酸可与HgC12形

10、成不溶性汞盐沉淀，后者经处理后又可获得游离组氨酸； 精氨酸可与苯甲醛生成水不溶性苯亚甲基精氨酸沉淀，后者用盐酸除去苯甲醛即可得精氨酸。,（3）吸附法 是利用吸附剂对不同氨基酸吸附力的差异进行分离的方法。如颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸附力，故可从氨基酸混合液中将上述氨基酸分离出来。 （4）离子交换法 是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。氨基酸为两性电解质，在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，故同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同。,3、氨基酸的精制方法 分离出的特定氨基酸中常含有少量其它杂质，需进行精制，常用的有

11、结晶和重结晶技术，也可采用溶解度法或结晶与溶解度法相结合的技术。 丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pI为6.0，故丙氨酸可在pH6.0时，用50冷乙醇结晶或重结晶加以精制。 溶解度与结晶技术相结合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若将含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍体积（wv）的热水中，调pH4.0左右，经脱色过滤可除去大部分酪氨酸；滤液浓缩至原体积的13，加2倍体积（vv）的95乙醇，4放置，滤取结晶，,用95%乙醇洗涤，烘干即得苯丙氨酸精品。 （二）用水解法生产氨基酸的品种及工艺 绝大多数氨基酸均可采用酸水解法生产，但目前由于发酵方法及酶工程技术的迅速发

12、展，仅有几种氨基酸仍采用酸水解法生产。现胱氨酸及亮氨酸生产为例。 1、L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制备 （1）L-胱氨酸的结构与性质 L-胱氨酸存在于所有蛋白质分子中，尤以毛、发及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由两分子半胱氨酸脱氢氧化而成，结构为：,L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶体，分解点258261，pI为5.05，25D 为-232。在25水中溶解度为0.011，在75水中为0.052。溶于无机酸及无机碱，在热碱液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮。可被还原为L-半胱氨酸。 （2）工艺路线,（3）工艺过程 水解 110117水解7h（自100时计）后出料,玻璃

13、布过滤,收集滤液。 中和 直至pH4.8，静置36h，涤纶布滤取沉淀，离心甩干得L-胱氨酸粗品。 粗制 升温至6570，搅拌半小时，加活性炭16kg，于8090保温半小时，滤除活性炭。调滤液至pH4.8，静置结晶，吸出上清液后，底部沉淀经离心甩干得胱氨酸粗品（）。,精制 中和 升温至70，加活性炭1.52.5kg，85搅拌半小时，过滤，加1.5倍体积蒸馏水，升温至7580，搅拌下用12氨水（化学纯）中和至pH3.54.0，析出结晶，滤取胱氨酸结晶，蒸馏水洗至无氯离子，真空干燥得L-胱氨酸成品。 （4）检验 应为六角形或六角柱形白色结晶，含量在98.5以上，干燥失重小于0.5，炽灼残渣小于0.2

14、，氯化物小于0.15，铁盐小于0.001，重金属小于20ppm。,含量测定： （5）作用与用途 L-胱氨酸具有增强造血机能、升高白细胞、促进皮肤损伤的修复及抗辐射作用。临床上用于治疗辐射损伤、重金属中毒、慢性肝炎、牛皮癣及病后或产后继发性脱发。,2、L-亮氨酸（L-Leucine，L-leu）的制备 （1）L-亮氨酸的结构与性质 L-亮氨酸存在于所有蛋白质中，以玉米麸质及血粉中含量最丰富，其次在角甲、棉籽饼和鸡毛中含量也较多。L-亮氨酸为人体必需氨基酸之一，化学名称为2-氨基-4-甲基戊酸或2-氨基异己酸，分子式：C6H13NO2,分子量：131.17 ,结构式：,L-Leu自水及乙醇中得白色

15、片状结晶，pI为5.98，熔点为293，在25水中溶解度为2.19，乙醇中为0.017;在75水中为3.82，在醋酸中为10.9，不溶于乙醚。 （2）工艺路线：,（3）工艺过程： 水解、赶酸 取6molL HC1 500L于1吨水解罐中，投入100kg动物血粉，110120回流水解24h后，于7080减压浓缩至糊状。加50L水稀释后，再浓缩至糊状，如此赶酸三次，冷却至室温滤除残渣。 吸附、脱色 上述滤液稀释1倍后，以每分钟0.5L的流速流进颗粒活性炭柱（30180cm）至流出液出现苯丙氨酸为止，用去离子水以同样流速洗至流出液pH4.0为止，穿柱液与洗涤液合并。,浓缩、沉淀与解析 上述流出液减压

16、浓缩至进柱液体积的13，搅拌下加入110体积（vv）的邻二甲苯-4-磺酸，产生亮氨酸磺酸盐沉淀。滤取沉淀并用2倍体积（wv）去离子水搅拌洗涤两次，抽滤压干得亮氨酸磺酸盐。滤饼加2倍体积（wv）去离子水搅匀，用6mol/L 氨水中和至pH68，7080保温搅拌1h，冷却过滤。沉淀用2倍体积（wv）去离子水搅拌洗涤两次，过滤得亮氨酸粗品。 精制 L-亮氨酸粗品用40倍体积（wv）去离子水加热溶解，加0.5活性炭于70搅拌脱色1h，过滤，滤液浓缩至原体积的14，冷却后即析出白色片状亮氨酸结晶。过滤收集结晶，用少量水洗涤、抽干，7080烘干得L-亮氨酸成品。,（4）检验 应为白色片状结晶，含量98.5

17、101.5%，干燥失重不超过0.2，炽灼残渣不超过0.4，氯化物不超过0.05，铁盐不超过0.003%，重金属不超过0.0015，砷盐不超过1.5ppm。 含量测定 （5）作用与用途 L-亮氨酸为人体必需氨基酸之一，是各种氨基酸输液的原料之一。,二、发酵法 （）基本原理与过程 1、发酵的基本原理 生物化学中称酵母无氧呼吸过程为发酵，反应过程中电子供体与受体皆为有机物，有时电子受体为电子供体的分解产物，氧化作用不完全，最终形成还原性产物。 工业上，发酵实质上是利用微生物细胞中酶的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其它有机物的过程。,图, 初生氨基酸：微生物通过固氮作用、硝酸还原及自外界吸收氨使酮

18、酸氨基化成相应的氨基酸，或微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的新氨基酸也称为初生氨基酸。 次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸为前体转化成的其它氨基酸。 大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的微生物转化作用而产生。,2、发酵法的基本过程 发酵法生产氨基酸的基本过程包括培养基配制与灭菌处理，菌种诱变与选育，菌种培养、灭菌及接种发酵，产品提取及分离纯化等步骤。 现代生物工程采用细胞融合技术及基因重组技术改造微生物细胞，已获得多种高产氨基酸杂种菌株及基因工程菌。 如用北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合形成的杂种，其中70杂种细胞产生两亲菌株所产生的氨基酸。,

19、氨基酸发酵方式主要是液体通风深层培养法，其过程是由菌种试管培养逐级放大直至数吨至数百吨发酵罐。发酵结束，除去菌体，清液用于提取、分离纯化和精制有关氨基酸，其分离纯化、精制方法及过程与水解法相同。 （二）发酵法生产的氨基酸品种及工艺 构成动物、植物及微生物体所有蛋白质的氨基酸种类与构型均无任何差异，但植物体内所有氨基酸皆由CO2、氨和水合成，动物体除8种必需氨基酸需从外界摄取外，其余非必需氨基酸均可通过体内氨基酸之间的转化或碳水化合物中间代谢物而合成，而微生物利用碳源、氮源及盐类几乎可合成所有氨基酸。,目前绝大部分氨基酸皆可通过发酵法生产，其缺点是产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周

20、期长，成本高。本文仅以L-异亮氨酸及L-赖氨酸直接发酵法为例，说明发酵法的基本过程。 1、L-异亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制备 （1）L-异亮氨酸的结构与性质：L-Ile存在子所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一，分子式为C6H13NO2，分子量为131.17，结构式为：,L-Ile在乙醇中形成菱形叶片状或片状晶体，分解点为285286，L-Ile溶于热醋酸，在20乙醇中溶解度为0.072，在25水中为4.12，在75水中为6.08，不溶于乙醚。 （2）工艺路线,（3）工艺过程 菌种培养 种子培养基组成（%）为： 葡萄糖 2 尿素 0.3 玉米浆 2.5 豆饼水解液0.1（

21、以干豆饼计） pH6.5。 二级种子培养基另加菜籽油0.4，其余同一级种子培养基。 一级种子培养：1000ml三解瓶中培养基装量为200ml，接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种，摇床30培养（冲程7cm，频率105次min）16h。 二级种子培养：接种量3.5，培养8h，如此逐级,放大培养得足够量菌种。 灭菌、发酵 发酵培养液组成（%）为: 硫酸铵 4.5 豆饼水解液 0.4，玉米浆 2.0 碳酸钙 4.5 pH7.2，淀粉水解还原糖初糖浓 度 11.5。 在5m3发酵罐中添加3吨发酵培养液，加热至118120，维持在1.1105Pa压力，灭菌30min，立即通冰盐水冷却至25。接入1菌种（

22、vv），维持180转min的搅拌速度，升温至3031，,以0.2L（minL）通气量发酵60h，在2450h之间不断补加尿素至0.6，氨水至0.27。 除菌体、酸化 发酵结束后，发酵液加热至100并维持10min，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。 离子交换、吸附分离 上述滤液每分钟以树脂量1.5的流速进H十-型732离子交换柱（40100cm），以100L去离子水洗柱，再以60、0.5molL氨水按3L/min的流速进行洗脱，分部收集洗脱液。, 浓缩赶氨 合并pH312的洗脱液，7080减压蒸馏、浓缩至粘稠状，加去离子水至原体积的14，再浓缩至粘稠状。如此重复三次。 脱

23、色、浓缩、中和 上述浓缩物加去离子水至原体积的14，搅拌均匀，加2molL盐酸调pH3.5，加上1（wv）活性炭，70搅拌脱色1h。滤除活性炭，滤液减压浓缩至适当体积，用2molL氨水调pH6.0，5沉淀过夜,过滤抽千，105烘干得：L-异亮氨酸半成品。,精制、烘干 每10kg L-异亮氨酸半成品加8L浓盐酸和20L去离子水，加热至80，搅拌溶解，加10kg氯化钠至饱和，加工业液碱调pH1.5，过滤，滤液用碱调pH 1.5，5放置过夜。滤取沉淀，用80L，去离子水加热至80搅拌溶解，加适量氯化钠和1%（wv）活性炭，70搅拌脱色lh过滤，滤液减压浓缩至适当浓度，用氨水调pH6.0，5放置结晶过

24、夜。次日过滤收集结晶，抽干，于105烘房中烘干得L-异亮氨酸成品。 （4）检验 应为菱形叶片状或片状晶体，含量应为98.5101.5，干燥失重不超过0.3，炽灼残渣不大于含量测定与L-亮氨酸的规定相同。,0.3%，氯化物不超过0.05，硫酸盐不超过0.03，铁盐不超过0.003,重金属不超过0.0015，砷盐不超过1.5ppm。 （5）作用与用途 L-Ile为必需氨基酸，是复方氨基酸输液的重要成份之一。 2、L-赖氨酸（L-Lysine，L-Lys）的制备 （1）L-赖氨酸的结构和性质 L-赖氨酸存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一。分子量为146.20，结构为：,L-Lys自乙醇水溶液中

25、得针状结晶，其盐酸盐为单斜晶系白色粉末，无臭、味苦，熔点263264，易溶于水，几乎不溶于乙醇和乙醚。PI为10.56， （2）工艺路线,（3）工艺过程 菌种培养 菌种为北京棒状杆菌（corymebacterium perkinense）AS l.563。斜面培养基成分（）为: 葡萄糖0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨0.5，琼脂2.0，pH7.0。 种子培养基成分（%）为: 葡萄糖2.0，磷酸氢二钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸铵0.4，玉米浆2.0，毛发水解废液1.0，pH6.87.0，CaCO3 0.5。 1000ml三角瓶中种子培养基装量200ml，接种一环斜面培养菌种，30振摇（冲程7.6c

26、m，频率108次min），培养16h。,二级种子培养接种量2.5，培养48h。如此逐级扩大培养。 灭菌、发酵 发酵培养液成分（）为 淀粉水解糖13.5，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸铵1.2，尿素0.4，玉米浆1.0，毛发水解废液1.0，甘蔗糖蜜2.0，pH6.7，灭菌前加甘油聚醚lL（指5m3发酵罐）。在5m3发酵罐中投入培养液3吨，在1.01105Pa压力下，加热至118120灭菌30min，立即通入冰盐水冷却至30，按10（vv）比例接种，以1:0.6（vv）通气量于30发酵4251h，搅拌速度为180转min。, 发酵液处理：离心除菌体；80 加热； 离子交换：铵型732树脂;

27、PH=5.0为饱和(串联) 浓缩结晶：收集PH=8.014.0洗脱液（氨水洗脱）,三、酶转化法 （一）基本原理及过程 酶转化法亦称为酶工程技术，实际上是在特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸的技术。 酶工程法与直接发酵法生产氨基酸之反应本质相同，皆属酶转化反应，但前者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化。 酶工程技术工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少。 固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可长期反复使用。,（二）酶转化法生产的氨基酸品种及工艺 目前医药工业中，用酶工程法生产的氨基酸已有十多种。 DL-蛋氨酸、DL-缬氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-色

28、氨酸、DL-丙氨酸及DL-苏氨酸等分别经氨基酰化酶拆分获得了相应的L-氨基酸，并已投入了工业化生产。 1、L-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备 （1）L-天冬氨酸及L-丙氨酸的结构与性质 L天冬氨酸（L-Aspartic acid，Asp）的结构与性质 L-Asp存在于所有蛋白质分子中，含两个羧基和一个氨基，为酸性氨基酸，分子式为C4H7NO4，分子量为133.10，结构式为：,L-Asp的化学名称为-氨基丁二酸或氨基琥珀酸，纯品为白色菱形叶片状结晶，等电点为2.77，熔点为269271。溶于水及盐酸，不溶于乙醇及乙醚，在25水中溶解度为0.8，在75水中为2.88，在乙醇中为0.00016。在碱性

29、溶液中为左旋性，在酸性溶液中为右旋性。25D 为 +5.05（C0.52.0，在水中）， 25D为 +25.4（C0.52.0，在5molL HCl中）。,L-丙氨酸（L-Alanine，简称L-Ala）的结构与性质 L-Ala存在于所有蛋白质分子中,为中性氨基酸。分子式为C3H7NO2，分子量为89.09，结构式为：,L-Ala自水和乙醇中形成菱形结晶，等电点为6.0，分解点为297，在25水中溶解度为16.65，在75水中为28.5，在20乙醇中为0.16，不溶于丙酮及乙醚。25D 为+18（C0.52.0，在水中）， 25D为-14.6（C0.52.0，在5molL HCl中）。,（2）

30、L-Asp和L-Ala的酶转化反应,（3）工艺路线,固定化酶 凡限制在一定的空间范围内并能连续反复的使用的酶都称为固定化酶。 通常采用的固定化方法可大体概括为四种类型：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。 吸附法 这是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，又可分：物理吸附和离子交换吸附。 物理吸附是通过氢键、疏水键和电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。 常用的载体有：皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶和微孔玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原、赛珞玢以及火棉胶等有机吸附剂。,最常用的交换剂有CM（羧甲基）纤维素、DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素、DEAE葡聚糖凝胶等

31、。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，约50150mg蛋白g载体。 共价偶联法 这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法。 常用的载体有：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐共聚物、聚苯乙烯、尼龙等；还有无机载体如多孔玻璃等。,交联法 利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子与 惰性蛋白间、或酶分子与载体间进行交联反应以共价键制备固定化酶。 包埋法 将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。 （1）胶格包埋最常用的包埋剂是聚丙烯酰胺凝胶，它以丙

32、烯酰胺为单体、N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂聚合而成。,（2）微囊型包埋是用直径几十到几百微米、厚约25nm的半透膜将酶分子进行包埋固定化的方法。 （3）脂质体包埋 脂质体是指具有脂双层结构和一定包裹空间的微球体。 辅酶及偶联酶的固定化 辅酶物质的固定化一般采用载体共价偶联法。,（4）工艺过程 菌种培养 大肠杆菌（Esscherichia coli）AS1.881的培养 斜面培养基为普通肉汁培养基； 摇瓶培养基成分（）为玉米浆7.5，反丁烯二酸2.0，MgSO47H2O0.02，氨水调pH6.0,煮沸后过滤，500ml三角烧瓶中培养基装量50100m1。 从新鲜斜面上或液体中培养种子，接种于

33、摇瓶培养基中，37振摇培养24h，逐级扩大培养至10002000L规模。培养结束后用1molL HCl调pH5.0，升温至45并保温1h，冷却至室温，转筒式高速离心机收集菌体（含天冬氨酸酶），备用。,德阿昆哈假单胞菌（Pseudomonas dacunhae）68变异株的培养 斜面培养基组成（）为 蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaC1 0.5，pH7.0，琼脂2.0。 种子培养基与斜面培养基相同，唯不加琼脂，250ml三角烧瓶中培养基装量为40m1。 摇瓶培养基组成（）为L-谷氨酸3.0，蛋白胨0.9，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氯钾0.05，MgSO47H2O 0.01，用

34、氨水调pH 7.2，500ml三角瓶中培养基装量为80ml。,将培养24h的新鲜斜面菌种接种于种子培养基中，30振摇培养8h，再接种子摇瓶培养基中，30振荡培养24h，如此逐级扩大至10002000L的培养罐培养。培养结束后用1molLHCl调pH至4.75，于30保温1h，用转筒式高速离心机离心收集菌体（含L-天冬氨酸-脱羧酶），备用。 细胞固定Ecoli的细胞固定 取湿菌体20kg悬浮于80L，生理盐水（或离心后的培养清液）中，保温至40，再加入90L保温至40的12明胶溶液及10L1.0戊二醛溶液，充分搅拌均匀，放置冷却凝固，再漫于0.25戊二醛溶液中。于5过夜后，切成35mm的立方小块

35、，浸于0.25戊二醛溶液中5过夜、蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶的固定化E.coli，备用。,假单胞菌体固定 取湿菌体20kg，加生理盐水搅匀并稀释至40L，另取溶于生理盐水的5角叉菜胶溶液85L，两液均保温至45后混合，冷却至5成胶。浸于600L2%KCl和0.2molL己二胺的0.5molL pH7.0的磷酸缓冲液中，5下搅拌10分钟，加戊二醛至0.6molL浓度，5搅拌30分钟，取出切成35mm的立方小块，用2% KCl溶液充分洗涤后，滤去洗涤液，即得含L-天冬氨酸-脱羧酶的固定化细胞，备用。,转化反应 将保温至37的lmolL延胡索酸铵（含1mmolL MgC12，pH8.5）底物

36、溶液按一定空间速度（Sv）连续流过生物反应堆I，控制达到最大转化率（95）为限度，收集转化液制备L-Asp或用于生物反应堆的再转化。 当需要生产L-丙氨酸时，向上述转化液中加磷酸吡哆醛至0.1mmolL浓度，调pH6.0，保温至37，按一定空间速度流入1.515105Pa压力下的生物反应堆，控制达到最大转化率（95）为限，收集转化液，用于制取L-丙氨酸。,产品纯化与精制 生物反应堆转化液经过滤澄清，搅拌下用1molL HCl调pH2.8，5结晶过夜，滤取结晶，用少量冷水洗涤抽干，105干燥得L-Asp粗品。粗品用稀氨水溶解（pH5）成15溶液，加1%（wv）活性炭，70搅拌脱色1h过滤,滤液于

37、5结晶过夜，滤取结晶，85真空干燥得药用L-Asp。 生物反应堆转化液过滤澄清，于6070下减压浓缩至原体积的50，冷却后加等体积甲醇，5结晶过夜，滤取结晶并用少量冷甲醇洗涤抽干，80真空干燥得L-Ala粗品。粗品用3倍体积（wv）去离子水于80搅拌溶解，加0.5%（wv）药用活性炭于70搅拌脱色1h，过滤，滤液冷后加等体积甲醇，5结晶过夜，滤取结晶，于80真空干燥得药用LAla。,（5）检验 （6）作用与用途 L-Asp有助于鸟氨酸循环，促进氨和CO2生成尿素，降低血中氨和CO2,增强肝功能，消除疲劳，用于治疗慢性肝炎、肝硬化及高血氨症。同时L-Asp和L-Ala都是复合氨基酸输液的原料。

38、2，酶拆分法制备L-苯丙氨酸 （1）L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-phe）的结构与性质 L-phe，存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一，其分子式为C9H11NO2，分子量为165.19，结构为：,L-Phe自水中结晶成白色叶片状晶体，无臭，微苦，pI为5.48；分解点为283284。在25水中溶解度为2.96，在75水中为6.62，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。1%水溶液pH为5.46.0。25D为-4.47（C0.52.0，在5molL HCl中），25D为-34.5（C0.52.0，在水中）。 （2）酶拆分DL-Phe的原理：DL-Phe与醋酸酐反应生成乙酰-DL

39、-Phe（Ac-DL-Phe），氨基酰化酶可专一性水解Ac-L-Phe的酰胺键生成L-Phe，而不水解Ac-D-Phe酰胺键，再利用L-Phe与Ac-D-Phe在水中溶解度的差异进行分离。 Ac-D-Phe又可经消旋生成Ac-DL-Phe，再行水解和分离，如此反复进行，可将DL-Phe全部转化为L-Phe。DL-Phe拆分的基本反应过程如下：,（3）工艺路线,（4）工艺过程 固定化氨基酰化酶的制备 取DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基乙基葡聚糖,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克）于去离子水中充分浸泡后，依次用10倍量0.5molL H

40、Cl和0.5molL NaOH溶液搅拌处理30min，再用去离子水洗至中性，然后依次用0.1molL及0.01molL的pH7.0磷酸缓冲液处理12h，滤干备用。,另取培养4050h的米曲扩大曲用6倍量去离子水分两次抽提，滤去残渣。滤液用2molL NaOH溶液调pH6.77.0，按100L酶液加1kg已处理的湿DEAE-SephadexA-50的比例混合，于04搅拌吸附45h，滤取DEAE-Sephadex A-50，依次用去离子水、0.1molL醋酸钠、0.01molL的pH7.0磷酸缓冲液洗涤34次，滤干得固定化氨基酰化酶，加1甲苯后于冷库中贮存，备用。 Ac-DL-Phe的制备 将DL

41、-Phe、冰醋酸及醋酸酐按171（wVv）的比例加入反应釜中，90反应45h，回收醋酸，浓缩液加一定量去离子水，再浓缩至一定体积，冷却结晶，滤取结晶于60真空干燥得AcDLPhe。,酶水解 在1000L反应罐中加700L 0.1molL Ac-DL-Phe钠盐溶液，搅拌下滴加6molL HCl至pH6.77.0，加1520kg固定化氨基酰化酶，50反应45h，过滤，滤液待分离LPhe，固定化酶再用于转化。 分离纯化 上述滤液用6molL HCl调至pH4.85.1，减压浓缩至35L左右，浓缩液于0结晶过夜，滤取结晶并用10L冷乙醇洗涤三次，抽干,于80烘34h，得LPhe粗品。滤液和洗涤液合并

42、后减压浓缩至20L左右，得Ac-D-Phe溶液，待消旋和再转化。,精制 取50L去离子水于100L反应罐中，加热至95100，投入5kg LPhe粗品，搅拌溶解，加药用活性炭0.25kg，搅拌脱色3min。趁热过滤，滤液转移至200L结晶罐中，冷却至40，加50 L 40 95乙醇，用6molL HCl调pH5.5，于0结晶过夜，滤取结晶，用10L冷乙醇洗涤34次，抽干，于80干燥34h。母液浓缩回收L-Phe结晶，所得结晶如上法重结晶一次，得药用LPhe。结晶母液及洗涤液合并,减压浓缩后转入粗品母液，待消旋。 AcDPhe的消旋 上述粗品及精品L-Phe母液及洗涤液合并后浓缩至60L,于10

43、0L反应罐中在搅拌下缓缓加入醋酸酐18.5L，在2545搅拌反应30min，冷却至室温，放置6h，用浓盐酸调PH l.52.0，5结晶过夜，滤取结晶，用去离子水洗涤35次，每次20L，抽干，于40真空干燥得AcDLPhe。,（5）检验 应为白色叶片状结晶，其含量应在98.5101.5之间，25D为-32.3+34.3，1水溶液pH为5.46.0，干燥失重应不超过0.3，炽灼残渣应不超过0.4，氯化物、硫酸盐及重金属均与异亮氨酸规定相同，砷盐应不超过1.5ppm，铁盐应不超过0.003%。 含量测定： （6）作用与用途 L-苯丙氨酸为复合氨基注射液的重要原料之一，也是合成苯丙氨酸 氮芥及对氟苯丙

44、氨酸等抗癌药的原料。,四、化学合成法 （一）基本原理与过程 以-卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐、乙酰氨基丙二酸二乙酯、卤代烃、-酮酸及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩合、取代及氢化还原等化学反应合成-氨基酸的方法称为化学合成法。 一般合成法和不对称合成法两大类。 一般合成法包括卤代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法、异氰酸酯（盐）合成法及醛缩合法等；产物皆为DL-型氨基酸混合物。 不对称合成法包括直接合成、-酮酸反应及不对称催化加氢等方法。产物为L-型氨基酸。,（二）化学合成法生产的氨基酸品种及工艺 理论上所有氨基酸皆可由化学合成法制造，但在目前，只有当采用其它方法生产很不

45、经济时才采用化学合成法生产，如甘氨酸、DL-蛋氨酸及DL-丙氨酸等 现仅介绍L-脯氨酸及L-苏氨酸的化学合成及其分离纯化工艺。,1、L-脯氨酸（L-Proline，L-Pro）的制备 （1）L-脯氨酸的结构与性质 L-脯氨酸存在于所有蛋白质中，鸡毛中含量较丰富。其化学名称为吡咯啶-甲酸或吡啶烷环-2-羧酸，分子式为C5H9NO2，分子量为115.13。 L-Pro自乙醇-乙醚中得白色粉末状结晶，pI为6.3，熔点220222。极易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。有旋光。 （2）合成路线 : L-Pro可采用化学合成法、发酵法及蛋白质原料水解分离法生产，合成法也有不同的原料和工艺。以浓硫酸为脱水剂，使

46、L-谷氨酸与乙醇缩合成L-谷氨酸-乙酯，后者经硼氢化钾还原即成L-Pro。,反应过程,（3）工艺路线,五氯酚乙醇溶液得复盐沉淀。 3%氨水解析 乙醚去杂质。 含量测定：,2、L-苏氨酸（L-Threonine，L-Thr）的制备 （1）L-苏氨酸的结构与性质 L-苏氨酸存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一。其分子式为C4H9NO3，分子量为119.12， L-Thr纯品为白色结晶或结晶性粉末，无臭，微甜，等电点为6.16,熔点为255257，溶于水，不溶于乙醇、乙醚及氯仿。在碱液中不稳定，受热易分解为甘氨酸和乙醛。 L-Thr分子中有两个不对称碳原子，故有LDThr和LD别苏氨酸四种异构体

47、，唯L-Thr具有生理活性。,（2）合成路线: L-Thr的合成原料为甘氨酸和乙醛。甘氨酸先与碱式硫酸铜反应生成甘氨酸铜，后者在碱性条件下与乙醛缩合成DL-Thr铜，并以播种结晶法（优先结晶法）拆分得L-Thr和D-Thr。反应过程为：,（3）工艺路线,拆分 取72L去离子水、20kg DL-Thr精品及2.25kg D-THr于200L反应罐中，搅拌下迅速升温到95至全溶，再迅速降温至40，投入225g D-Thr结晶，缓缓降温至2930，迅速过滤，滤饼于80，烘干得D-Thr粗品。滤液再投入与已分出的D-Thr等量的DL-Thr，余操作与拆分D-Thr相同，投入225g L-Thr结晶，最

48、后得L-苏氨酸粗品。母液再投入适量D-Thr、DL-Thr及水，令三者比例为1:0.93.2。,第三节 氨基酸输液 多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液谓之氨基酸输液。氨基酸输液可直接注入进食不足者的血液中，促进蛋白质、酶及肽类激素的合成，提高血浆蛋白浓度与组织蛋白含量，维持氮平衡，调节肌体正常代谢。 现已有含氨基酸数目为11、14、18及20种等多种输液类型，氨基酸浓度分别有3、5、9、10及12等多种规格。 有些氨基酸输液还加入山梨醇、木糖、维生素、Na、K、Ca2+或Mg2+等成分，以补充能量，提高氨基酸的利用率及其营养价值，也有些氨基酸输液与右旋糖酐配伍制成较理想的代血浆

49、。,一、氨基酸输液的组成与要求 输入人体的氨基酸种类、数量及比例需符合机体要求，否则利用度将下降，还会引起代谢失调、拮抗及中毒等代谢并发症。 （一）组方原理 体内蛋白质处于连续分解与合成的动态平衡状态，故氨基酸输液以被患者的有效利用为度。目前国内外生产氨基酸输液组方多采用人乳、全蛋白、FAO (Food and Agriculture Organization 联合国粮食及农业组织1973年联合国粮食组织和世界卫生组织研究提出的符合成人需要的8种必需氨基酸FAO/WHO模式)、FA-WHO或血浆游离氨基酸模式。组方中必须含八种必需氨基酸和两种半必需氨基酸，所有氨基酸均为L-型。另外，组方中尚需

50、含5山梨醇或木糖醇，以补充能量、促进氨基酸的吸收和利用，同时加半胱氨酸作为稳定剂，由此方能构成优良的氨基酸输液。,（二）处方中氨基酸的组成与比例 1、氨基酸的构型 最理想的情况是全部使用L-氨基酸配制输液。 2、必需氨基酸与非必需氨基酸的比例 非必需氨基酸可由必需氨基酸或碳水化合物转化而来，补充非必需氨基酸可减少体内必需氨基酸的消耗。输液中必需氨基酸（E）与非必需氨基酸（N）之比（EN）依具体情况而定。一般在1：11：3之间； 必需氨基酸（E）占总氨基酸的5075；必需氨基酸（E）与总氮量（T）之比以3为宜。 国内氨基酸输液的总含氮量为0.60.8。,二、氨基酸输液的配方 氨基酸输液可参考 F

51、AO-WHO氨基酸代谢模式、人血浆白蛋白、全蛋蛋白质或人乳的氨基酸组成模式制订配方。 三、氨基酸输液配制 复方氨基酸配方种类较多，配制方法亦不尽相同。但其过程均需活性炭脱色，且需维持一定pH范围。活性炭对芳香族氨基酸吸附力强，引起损失，使其含量下降，故配料时需将芳香族氨基酸用量增加20%以弥补损失，或将活性炭先用1苯丙氨酸吸附饱和后再应用。输液的pH值一般在4.06.0为适宜，pH5.5最佳，酸度过大或接近中性皆影响色泽和产品质量。,复方氨基酸输液配制工艺如下: （1）稳定及难溶氨基酸的溶解 取新鲜注射用水（约全量的23）于容器中，加温至90，将亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、天冬

52、氨酸及谷氨酸依次投入，充分搅拌溶解，停止加热，加入色氨酸搅拌溶解。 （2）加易溶氨基酸及稳定剂 投入其它易溶氨基酸及稳定剂（亚硫酸氢钠及半胱氨酸各加至全量浓度为0.05），搅拌溶解，迅速降至室温，加注射用水至近全量，用10氢氧化钠液调pH4.55.5,加注射用水至全量。,（3）脱色与灌封 上述溶液加0.10.2（wv）的活性炭，搅拌30min，滤除活性炭，再用分子量截留值为1万2万的超滤膜滤器过滤，滤液分装于250ml或500ml输液瓶中，按常规操作压盖后，于105流动蒸气灭菌30min即得成品。 四、质量标准 复方氨基酸注射液种类较多，各自标准不同。现介绍“11种氨基酸注射液”的质量标准。

53、本品为无色或淡黄色的澄明液体，每种氨基酸含量均应为标示量的80.0土120.0。其处方中每升溶液里各氨基酸的量分别为（g）：L-Leu 10.0，L-Ile 6.6，L-Phe9.9， L-Thr 7.0， L-Va1 6.4， L-Met 6.8， L-Trp 3.0， L-Lys 15.4， L-Arg 9.0， L-His 3.5及Gly 60。,本品pH值为5.57.0，与茚三酮呈紫色反应，与硫酸锌及溴试剂呈淡红色反应。色氨酸采用分光光度法测定，其余氨基酸采用氨基酸自动分析仪或高效液相色谱仪分离测定。其它如安全试验、热原及降压物质等均应符合中国药典1990年版的有关规定。 五、作用与用途 对代谢旺盛的病人及严重消耗性病人的蛋白质合成有促进作用。用于治疗肝性昏迷、消化道吸收功能障碍引起的低蛋白血症、大面积烧伤、严重创伤及感染等疾患。,