EMSA常见问题解答

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1、如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在？页首回到专辑部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体，可进行超迁移实验，抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。增量的抗体加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度的减少。在大多数实验

2、中，应对抗体作滴定，先使抗体：蛋白的摩尔比为1：1，然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时，可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁移实验外，复合物中蛋白的特征也可用UV交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后，用UV照射使复合物交联，随后用DNA酶降解未保护的探针。需用均质标记的探针，因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及

3、突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。为什么看不到Super-Shift的带？页首回到专辑在Super-ShiftEMSA测定中看不到Super-ShiftDNA/蛋白复合物带可能有以下原因：1）测定体系中没有活化的TF。一般先做一般的EMSA测定与竞争实验证明确有活化的TF存在。成功后才考虑做Super-ShiftEMSA实验。2）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-ShiftEMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-ShiftEMSA。3）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时

4、既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。4）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。4）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的DNA探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。

5、所加入反应的探针的量是50,000-200,000cpm32P-标记的探针（高特异活性）或10pm的非放射性标记探针，反应体积为10-20ml。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80oC、探针应保存在-20oC以防止降解。无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。Poly(dI:dC)(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？Poly(dI:dC)(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)(dI:dC)的用量需在正式实验前进

6、行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1ugpoly(dI:dC)(dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的

7、存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍(w/w)。小牛胸腺DNA有可能代替poly(dI:dC)(dI:dC)用于EMSA，但效率很差而且可能带有与靶蛋白的结合位点。美国Invitrogen公司出售的EMSA试剂采用荧光染料直接对DNA/蛋白复合物中的DNA进行染色，操作简单，但因染料同时也使Poly(dI:dC)(dI:dC)染色，基本不能够用于组织与细胞核抽提液中DNA结合蛋白的测定。页首回到专辑进行Super-Shift应当考虑的因素。在EMSA测定中，如果需要对DAN/蛋白复合物的构成成分进行鉴定，就需要进行Super-Sh

8、iftEMSA测定。Super-ShiftEMSA的工作原理很简单；在反应体系中，抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。进行Super-ShiftEMSA需要考虑以下因素：1) 一般先做一般的EMSA测定。成功后才考虑做EMSA实验。2) 不是所有的抗体都可以用于Super-ShiftEMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-ShiftEMSA;3) 抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1U1原倍的抗体；3) 为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。

9、4) 单抗与多抗都可用于Super-ShiftEMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？页首将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（30：1丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。pH,聚丙烯酰胺的浓度，丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁移。大多数蛋白用10-15伏的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压（

10、30-35伏的电压），电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。低的离子强度和丙烯酰胺基质的箱子效果有助于复合物的稳定。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris，pH8.3,95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphoragarose）。