第三章组织培养

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1、第三章第三章 园林植物苗木培育技术园林植物苗木培育技术3.4组织培养育苗组织培养育苗植物组织培养：根据植物细胞的全能性原理，将植物的器官、植物组织培养：根据植物细胞的全能性原理，将植物的器官、组织、细胞，接种到人工配制的培养基上，在人工控制的条组织、细胞，接种到人工配制的培养基上，在人工控制的条件下，进行离体培养，使其产生完整植株的过程。件下，进行离体培养，使其产生完整植株的过程。试管苗试管苗3.4.1植物组织培养技术的实用性特点植物组织培养技术的实用性特点（1）植株组培快繁、周期短、节省材料）植株组培快繁、周期短、节省材料（2）应用广泛）应用广泛3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的

2、育苗技术 1）基本条件）基本条件（1）实验室）实验室洗涤室洗涤室称量室称量室3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（1）实验室）实验室培养基制备室培养基制备室灭菌室灭菌室3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（1）实验室）实验室接种室接种室缓冲室缓冲室3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（1）实验室）实验室培养室培养室3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（1）实验室）实验室培培 养养 室室准准 备备 室室灭菌室灭菌室储藏室储藏室接种

3、室接种室缓冲室缓冲室植物组织培养实验室布局示意图植物组织培养实验室布局示意图为了减少污染，实验室最好设一走廊且走廊上方最好安装紫外灯；为了减少污染，实验室最好设一走廊且走廊上方最好安装紫外灯；培养室最好设在南面，设大玻璃窗，以双层玻璃窗为最好。如果培养室是设培养室最好设在南面，设大玻璃窗，以双层玻璃窗为最好。如果培养室是设在房屋的边侧，其东边或西边的墙上也可设置大玻璃窗；在房屋的边侧，其东边或西边的墙上也可设置大玻璃窗；培养室房间及门要小，而且密闭性要好，最好装移门；培养室房间及门要小，而且密闭性要好，最好装移门；无菌操作室要小，要设缓冲间，也最好装移门，且门要稍大一些。无菌操作室要小，要设缓

4、冲间，也最好装移门，且门要稍大一些。3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（2）仪器设备和用具）仪器设备和用具酸度计酸度计细菌过滤器细菌过滤器超净工作台超净工作台3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（2）仪器设备和用具）仪器设备和用具高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（2）仪器设备和用具）仪器设备和用具3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（2）仪器设备和用具）仪器设备和用具3.4.2植物组织培养的育苗

5、技术植物组织培养的育苗技术 1）基本条件）基本条件（3）培养容器）培养容器3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（1）玻璃器皿洗涤）玻璃器皿洗涤3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（2）培养基配制）培养基配制培养基的重要性培养基的重要性基本培养基：指只含有维持离体植物细胞基本生命活基本培养基：指只含有维持离体植物细胞基本生命活动所需的营养成分的培养基。动所需的营养成分的培养基。通常包括水分、无机营通常包括水分、无机营养成分和有机营养成分，不包括激素和天然有机附加养成分和有机营养成分，不包括激素和天然有机附加物。物

6、。完全培养基：指在基本培养基的基础上另外附加激素完全培养基：指在基本培养基的基础上另外附加激素或天然有机附加物所组成的培养基。或天然有机附加物所组成的培养基。培养基的构成培养基的构成培养基培养基水水无机盐类无机盐类有机营养有机营养大量元素化合物大量元素化合物微量元素化合物微量元素化合物氨基酸类氨基酸类糖类糖类维生素类维生素类植物生长调节剂植物生长调节剂生长素类生长素类细胞分裂素类细胞分裂素类凝固剂凝固剂组织培养时，植物激素的使用规律组织培养时，植物激素的使用规律 在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，但二者在使用上有一定的顺序关系，处理

7、的趋势，但二者在使用上有一定的顺序关系，处理顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下：顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下：先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不容易分化，容易产生多倍体细胞。胞分裂，但细胞不容易分化，容易产生多倍体细胞。先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂也分化。也分化。用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官分化方向

8、：生长素分化方向：生长素/细胞分裂素比值高时，有利于根细胞分裂素比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。高无机盐含量的培养基高无机盐含量的培养基 代表类型：代表类型：MSMS，LSLS，BLBL，ERER硝酸钾含量较高的培养基硝酸钾含量较高的培养基 代表类型：代表类型：B5B5，N6N6，SHSH中等无机盐含量的培养基中等无机盐含量的培养基 代表类型：代表类型：NitschNitsch，MillerMiller低无机盐含量的培养基低无机盐含量

9、的培养基 代表类型：代表类型：WhiteWhite，WSWS，HEHE培养基的配方培养基的配方成成 分分使用浓度使用浓度(mg/L)成成 分分使用浓度使用浓度(mg/L)硝酸钾（硝酸钾（KNO3）1900碘化钾（碘化钾（KI）0.83硝酸铵（硝酸铵（NH4NO3）1650硼酸（硼酸（H3BO3）6.2磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（KH2PO4）170硫酸锌（硫酸锌（ZnSO47 H2O）8.6硫酸镁（硫酸镁（MgSO4 47H2O）370钼酸钠（钼酸钠（Na2MoO42 H2O）0.25氯化钙（氯化钙（CaCl22H2O）440硫酸铜（硫酸铜（CuSO45 H2O）0.025硫酸亚铁（硫酸亚铁（Fe

10、SO47H2O）27.8氯化钴（氯化钴（CoCl26 H2O）0.025硫酸锰（硫酸锰（MnSO44H2O）22.3甘氨酸甘氨酸2乙二胺四乙酸二钠（乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）37.3盐酸硫胺素（盐酸硫胺素（VB1）0.1肌醇肌醇100盐酸吡哆醇（盐酸吡哆醇（VB6）0.5蔗糖蔗糖30000烟酸（烟酸（VB5或或VPP）0.5琼脂琼脂7000MS培养基配方培养基配方 成成 分分使用浓度使用浓度(mg/L)成成 分分使用浓度使用浓度(mg/L)硝酸钾（硝酸钾（KNO3）2500碘化钾（碘化钾（KI）0.75硫酸铵（硫酸铵（NH4）2SO4）134硼酸（硼酸（H3BO3）3.0磷酸二氢钾（磷

11、酸二氢钾（KH2PO4）150硫酸锌（硫酸锌（ZnSO47 H2O）2.0硫酸镁（硫酸镁（MgSO4 47H2O）250钼酸钠（钼酸钠（Na2MoO42 H2O）0.25氯化钙（氯化钙（CaCl22H2O）150硫酸铜（硫酸铜（CuSO45 H2O）0.025硫酸亚铁（硫酸亚铁（FeSO47H2O）27.8氯化钴（氯化钴（CoCl26 H2O）0.025硫酸锰（硫酸锰（MnSO44H2O）10盐酸硫胺素（盐酸硫胺素（VB1）10乙二胺四乙酸二钠（乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）37.3盐酸吡哆醇（盐酸吡哆醇（VB6）1.0肌醇肌醇100烟酸（烟酸（VB5或或VPP）1.0蔗糖蔗糖20000琼

12、脂琼脂7000B5培养基配方培养基配方 成成 分分使用浓度使用浓度(mg/L)成成 分分使用浓度使用浓度(mg/L)硝酸钾（硝酸钾（KNO3）80硫酸锰（硫酸锰（MnSO44H2O）7氯化钾（氯化钾（KCl）65硼酸（硼酸（H3BO3）1.5硝酸钙（硝酸钙（Ca(NO3)24H2O300硫酸锌（硫酸锌（ZnSO47 H2O）3硫酸镁（硫酸镁（MgSO4 47H2O）720 硫酸铁（硫酸铁（Fe(SO4)3）2.5碘化钾（碘化钾（KI）0.75盐酸硫胺素（盐酸硫胺素（VB1）0.1硫酸钠（硫酸钠（NaSO4）200盐酸吡哆醇（盐酸吡哆醇（VB6）0.1磷酸氢钠（磷酸氢钠（NaH2PO4H2O）1

13、6.5烟酸（烟酸（VB5或或VPP）0.5甘氨酸甘氨酸3蔗糖蔗糖20000White培养基配方培养基配方 u基本培养基母液的配制基本培养基母液的配制 单配法单配法 混配法混配法 按照避免难溶性沉淀形成的原则和物质种类的不同，按照避免难溶性沉淀形成的原则和物质种类的不同，将基本培养基配方所包括的物质进行分组将基本培养基配方所包括的物质进行分组基本培养基配方中物质划分组数的多少，即配制母液基本培养基配方中物质划分组数的多少，即配制母液数的多少可根据实际情况而定，如数的多少可根据实际情况而定，如MSMS培养基可以配制培养基可以配制三液式、四液式、五液式等三液式、四液式、五液式等例如：例如：MSMS培

14、养基五液式培养基五液式大量元素母液大量元素母液钙盐母液钙盐母液微量元素母液微量元素母液铁盐母液铁盐母液有机营养成分母液有机营养成分母液3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（3）外植体消毒、接种）外植体消毒、接种接种：把处理好的材料经无菌操作程序放置到培养基上，接种：把处理好的材料经无菌操作程序放置到培养基上，这一过程这一过程外植体外植体u器皿和器具的洗涤器皿和器具的洗涤洗涤剂：无磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗洁精洗涤剂：无磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗洁精常用清洗方法：洗涤剂清洗法、超声波清洗法常用清洗方法：洗涤剂清洗法、超声波清洗法 消毒消毒 器皿消毒器皿消

15、毒u器具的灭菌方法器具的灭菌方法消毒消毒 器皿消毒器皿消毒干热灭菌法干热灭菌法高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法）高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法）火焰灼烧灭菌法火焰灼烧灭菌法u高温蒸汽灭菌法高温蒸汽灭菌法消毒消毒 培养基消毒培养基消毒培养基湿热灭菌最少时间培养基湿热灭菌最少时间液体容积（液体容积（ml）121所需时间（所需时间（min）20-50157520 250-50025 1000301500-200035-40培养基高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）操作培养基高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）操作灭菌后培养基的存放：灭菌后培养基的存放：锅内加水锅内加水放入消毒桶放入消毒桶装入培养基装入培养基盖好锅盖盖好锅盖接通电源加

16、热接通电源加热排尽锅内冷空气排尽锅内冷空气达到灭菌温度时开始计时达到灭菌温度时开始计时并保持足够长的时间并保持足够长的时间继续加热继续加热切断电源切断电源压力表指针归压力表指针归零时打开锅盖零时打开锅盖取出培养基取出培养基并存放好并存放好高压蒸汽灭菌锅安全使用注意事项：高压蒸汽灭菌锅安全使用注意事项：灭菌前外层锅内要加入足够的水灭菌前外层锅内要加入足够的水,灭菌完成后要将锅内灭菌完成后要将锅内的水排放干净。的水排放干净。在灭菌过程中及灭菌后，压力表压力指针归零之前在灭菌过程中及灭菌后，压力表压力指针归零之前,不不能打开锅盖能打开锅盖,以免发生危险。以免发生危险。注意日常维护和检查注意日常维护和

17、检查,及时发现问题及时发现问题,及时修理，保证使及时修理，保证使用安全可靠。用安全可靠。使用高压蒸汽灭菌锅进行物品灭菌时的注意事项：使用高压蒸汽灭菌锅进行物品灭菌时的注意事项：消毒锅内放置的物品要有一定的缝隙，便于高温蒸汽上消毒锅内放置的物品要有一定的缝隙，便于高温蒸汽上下回流，达到良好灭菌效果。下回流，达到良好灭菌效果。锅内冷空气必须完全排尽，否则压力表的指针虽然达到锅内冷空气必须完全排尽，否则压力表的指针虽然达到了规定的压力，但由于锅内冷空气的存在，并不能达到了规定的压力，但由于锅内冷空气的存在，并不能达到相应的温度，因而影响灭菌效果。相应的温度，因而影响灭菌效果。进行培养基灭菌时，锅内达

18、到规定的灭菌温度后，在严进行培养基灭菌时，锅内达到规定的灭菌温度后，在严格保持灭菌温度的同时，还要严格保持灭菌时间。时间格保持灭菌温度的同时，还要严格保持灭菌时间。时间过长会破坏培养基内一些化学成分的有效性，时间过短过长会破坏培养基内一些化学成分的有效性，时间过短则达不到灭菌效果。则达不到灭菌效果。u过滤除菌法过滤除菌法消毒消毒 培养基消毒培养基消毒消毒消毒 无菌操作室内的灭菌方法无菌操作室内的灭菌方法消毒消毒 外植体的表面灭菌外植体的表面灭菌 u化学消毒剂灭菌法化学消毒剂灭菌法7 70%0%酒精、酒精、HgClHgCl2 2、次氯酸钠、过氧化氢、次氯酸钙等、次氯酸钠、过氧化氢、次氯酸钙等外植

19、体表面灭菌操作前的准备工作：外植体表面灭菌操作前的准备工作：无菌水、漂洗瓶、切割用器皿和金属器具均经过高无菌水、漂洗瓶、切割用器皿和金属器具均经过高温高压灭菌并整齐摆放在超净工作台上。温高压灭菌并整齐摆放在超净工作台上。灭菌剂配制好并整齐摆放在超净工作台上。灭菌剂配制好并整齐摆放在超净工作台上。外植体表面灭菌的一般过程外植体表面灭菌的一般过程外植体取材外植体取材备用备用无菌水充分漂无菌水充分漂洗洗35次次无菌条件下，消毒剂处理无菌条件下，消毒剂处理无菌条件下，无菌条件下，70%酒酒精表面消毒精表面消毒30S60S预处理预处理影响外植体消毒效果的因素：影响外植体消毒效果的因素：消毒剂种类消毒剂种

20、类 消毒剂使用浓度消毒剂使用浓度 消毒处理时间消毒处理时间接种接种 全部应在无菌条件下进行全部应在无菌条件下进行u外植体接种操作前的准备工作外植体接种操作前的准备工作接种接种 全部应在无菌条件下进行全部应在无菌条件下进行u外植体接种的具体步骤外植体接种的具体步骤切割外植体切割外植体培养瓶倾斜靠近培养瓶倾斜靠近酒精灯火焰酒精灯火焰瓶盖外部在火焰上瓶盖外部在火焰上旋转灼烧数秒钟旋转灼烧数秒钟旋开瓶盖，扣放旋开瓶盖，扣放在酒精灯旁边在酒精灯旁边瓶口在火焰上旋瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟转灼烧数秒钟用无菌镊子将用无菌镊子将外植体均匀放外植体均匀放置在培养基上置在培养基上瓶盖在火焰瓶盖在火焰上灼烧两圈上灼

21、烧两圈盖紧瓶盖盖紧瓶盖接种接种 全部应在无菌条件下进行全部应在无菌条件下进行u常用外植体的种类常用外植体的种类茎尖茎尖带节茎段带节茎段节间部茎段节间部茎段叶片和叶柄叶片和叶柄鳞片鳞片3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（4）培养物的管理和试管苗的移栽）培养物的管理和试管苗的移栽u培养条件培养条件3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（4）培养物的管理和试管苗的移栽）培养物的管理和试管苗的移栽u继代培养继代培养3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（4）培养物的管理和试管苗的移栽）培养物的管理和试管苗的移栽u生根生根无根试管苗无根试管苗生根生根 诱导生诱导生根的基根的基本培养本培养基，生基，生长素长素3.4.2植物组织培养的育苗技术植物组织培养的育苗技术 2）操作技术）操作技术（4）培养物的管理和试管苗的移栽）培养物的管理和试管苗的移栽u移栽移栽