基础生物化学第3章

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1、10 DNA的生物合成 Chapter 10 DNA Biosynthesis，Replication,本章重点与难点 重点：掌握中心法则；半保留复制、半不连续复制、反转录、基因工程的概念；参与DNA复制的有关酶类和蛋白复制过程；DNA损质及DNA的伤修复的方式。 难点：对DNA的半保留复制、半不连续复制的理解。,遗传的中心法则,1958年Crick提出以DNA为中心的遗传信息的传递规律，即DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代DNA，通过转录传给RNA，再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为中心法则。,DNA,RNA,蛋白质,复制,复制,转录,翻译,反转录,1970年Temin

2、和Baltimore发现RNA病毒的RNA可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给cDNA，也可通过RNA复制或RNA转录传给子代RNA，这是对中心法则的补充。 1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向DNA传递。,？,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。 生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以亲代（母链）DNA为模板合成子链DNA的过程。,一、DNA复制的基本规律 （一般原理） Basic Rules of DNA Replication,复制的方式 半保留复制(s

3、emi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),（一）DNA复制是半保留复制(semi-conservative replication),DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制

4、。,半保留复制的概念,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复

5、制叉,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式（散布式）,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的密度飘移实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现

6、了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从原点 (起始点，origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,（二）DNA复制是固定起点的双向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个复制原点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻复制原点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是能够独立完成复制的功能单位。,（三）DNA复制是半不连续复制,领头链 (leading strand),

7、随从链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为先导链或领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随后链或随从链。复制中的不连续片段（约1000个核苷酸）称为岡崎片段(okazaki fragment，1968)。 先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连续复制或复制的半不连续性。,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为10

8、002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,（四）需要引物 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,二、DNA复制的酶学 （DNA复制相关的酶和蛋白质） The Enzymology of DNA Replication,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase)

9、: 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DDDP或DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,（一）复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,目 录,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板 DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。 新链的延长只可沿5 3方向进行（模板方向为 3 5 ，合成方向为5 3 。）,（二）DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-depe

10、ndent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段和RNA引物。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,1、原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,E. Coli中的DNA聚合酶,原核生物的DNA聚合酶,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶

11、活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol ：由十种亚基组成，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。 (250kD),2、真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校

12、读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,真核生物的DNA聚合酶,在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ）。 其中，参与染色体DNA复制的是pol （延长随从链）和pol （延长领头链），参与线粒体DNA复制的是pol ，pol与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，pol 只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。,（三）复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是

13、遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 复制的保真性和碱基选择,1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,2、复制的保真性和碱基选择, DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及

14、时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,（四）复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,1、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E. Coli 基因图,目 录,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,解螺旋酶（unwinding enzyme） ，又称解

15、链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。,单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为： 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA； 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。 引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段R

16、NA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。,2、DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目 录,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,目 录,（五）DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生

17、成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,P,O,O-,O-,O,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶催化的条件是： 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,三、DNA生物合成过程 The Process of

18、DNA Replication,1、复制的起始,需要解决两个问题：,1） DNA解开成单链，提供模板。,2）合成引物，提供3-OH末端。,（一）原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,a. DNA解链,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,b. 引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 预引发： 1解旋解链，形成复制叉： 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DN

19、A的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。,2引发体组装： 由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。,引发： 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,2、复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,聚合子代DNA： 由DNA聚合酶催化，以35方向的亲

20、代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中，是DNA聚合酶(延长随从链)和（延长领头链）。,引发体移动： 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,3、复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,去除引物，填补缺口： 在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最

21、后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,连接冈崎片段： 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,（二）真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物

22、酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,1、复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,2、复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,3、复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,切除引物的两种机制,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telome

23、rase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,四、逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),（一）逆转录病毒和逆转录酶,反转录（reverse transcription）：以RNA为模板，合成DNA。与

24、通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。 1970年，Temin 和Baltimore分别从致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中发现发反转录酶。 致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。 放线菌素D（抑制以DNA为模板的反应，复制和转录）能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。 Bader 用嘌呤霉素（puromycin）来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV），证实反转录酶是由

25、反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中新合成的。,反转录酶 由一个亚基和一个亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。 （1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNADNA杂种分子）。 （2）RNase H酶活力，水解RNADNA杂种分子中的RNA，可沿35和53两个方向起外切酶作用。 （3）DNA指导的DNA聚合酶活力。 模板：RNA或DNA 以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。 引物：RNA或DNA 底物：dNTP 二价阳离子：Mg2+或Mn2+ 真核mRNA3端有po

26、lyA，加入oligo dT后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA。,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,（二）逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制(rolling circle replicatio

27、n),（三）滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,五、DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。 一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。,从分子水平来看，

28、突变就是DNA分子上碱基的改变。,（一）突变的意义,1、突变是进化、分化的分子基础 2、突变导致基因型改变 3、突变导致死亡 4、突变是某些疾病的发病基础,（二）引发突变的因素,物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,化学因素,（三）突变的分子改变类型,错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,1、错配,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,2、缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链

29、从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变 。,缺失引起框移突变,3、重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,（四）DNA损伤的修复,修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复,修复的主要类型,1、

30、光修复,光修复酶(photolyase),UV,2、切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。包括切补切封四个步骤。,E.coli的切除修复机制,3、重组修复,切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。 在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。 重组修复至少需要4种酶组分。 重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。 recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。 此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。,

31、4、SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,诱导修复和应急反应（SOS反应） 诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。 SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复）和倾向差错的修复。 避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。 倾向差错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。,