作物保护优秀论文1

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1、几株木毒对四种植物病原菌的拮抗作用研究植物保护(检疫方向) 李德强指导教师 龚国淑教授摘要：通过将分离自九寨沟自然保护区土壤的木霉用对峙培养法和无菌发酵液培养法对西 瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、番石榴炭疽病菌、玉米小斑病菌的广谱抑制效果进行测定。 对峙培养结果表明，T8菌株的广谱抑制效果最好，T8对四种病原菌的抑制率分别为 60.22%、58.33%、54.90%和44.29%；其次T9对番石榴炭疽病菌、小麦赤霉病菌的拮抗效 果也很明显，其抑制率分别为63.31%和60.06%。无菌发酵液培养的抑菌结果表明，T8的 广谱抑制效果依然是最好的，对四种病原菌的抑制率在67.38%和50.59%之间；

2、其次T9的 表现也很突出，对番石榴炭疽病菌和小麦赤霉病菌，以及西瓜枯萎病菌的抑制率也分别达 到65.83%、64.37%和42.65%；与对峙培养相比较T8、T9和T10的广谱抑制效果都有所 提升，其中T10的提升效果最明显，但是T1的广谱抑制效果有小幅的下降。关键词：木霉；拮抗作用；对峙培养；无菌发酵液培养Antagonistic effect of several Trichoderma strainsagainst four plant pathogensPlant protection department (quarantine branch) Li DeqiangDirected

3、by Prof. Gong GuoshuAbstract： Broad-spectrum antagonistic effect of Jiuzhai Valley soil Trichoderma against Fusarium oxysporum.Melonis， Fusarium graminearumn Schw，Colletotrichum gloeospoioides Penzig and Bipolaris maydis (Nisikado et Miyake) Shoeml was studied by dual culture and fermentation broth

4、culture.The dual culture test shows that T8 strains appears best in broad-spectrum inhibition, its inhibition rate to the four pathogens is 60.22%， 58.33%，54.90% and 44.29%; then T9 also appears good in against Colletotrichum gloeospoioides Penzig and Bipolaris maydis (Nisikado et Miyake) Shoeml, th

5、e inhibition rate is 63.31% and 60.06% respectively, Aseptic fermentation broth culture medium result shows that T8 remains the best in broad-spectrum inhibition, its inhibition rate against the four pathogens is between 67.38% and 50.59%; also, T9 appears very good, its inhibition rate against Coll

6、etotrichum gloeospoioides Penzig, Bipolaris maydis (Nisikado et Miyake) Shoeml and Fusarium oxysporum.Melonis is 65.83%， 64.37% and 42.65%, Compared with Confrontation culture, the Broad-spectrum inhibitory effect of T8,T9,T10 all improved, among them, the improving degree of T10 ranks first, howeve

7、r, the Broad-spectrum inhibitory effect of T1 is a little bit lower. Key word : Trichoderma； Antagonism; Dual culture; Aseptic fermentation broth culture近年来，随着人们生活水平的提高、知识经验的积累，人们对生活质量的要求越来越 高，对环境污染的认识程度越来越深，所以人们极其渴望绿色食品的生产。但是随着农业 结构的调整，各地农作物种植面积逐年扩大，各种病害的发生更是日益严重。目前，控制 植物病害的主要手段是使用化学杀菌剂，但是化学杀菌剂防治时由

8、于其药效持续时间短， 随着它的大量使用，其有害物质在蔬菜、土壤等的蓄积量也逐渐增加，生态环境受到的破 坏越来越严重，其残留毒性对人类健康造成了严重的威胁，已成为全社会共同关心的问题。 而生物防治是从农业可持续发展宗旨出发，具有不污染环境、无农药残留和处理费用低廉 等优点，受到人们的广泛关注，在目前的植物病害防治方法中起着越来越重要的作用。因 而对拮抗微生物的研究及其在防治植物病害中的应用倍受关注，大大地推动了生物农药的 研制与发展。目前，在植物真菌病害的生物防治上，已开发出了许多生物农药，如井冈霉素、农抗 120.芽孢杆菌制剂、木霉菌制剂、菌根菌剂等，均已批量生产和大面积推广，取得了较好 的经

9、济效益和社会效益，并带来巨大而深远的生态效益。其中拮抗性木霉是一种很好的生 防微生物，它通过一系列拮抗作用能有效抑制病原菌的活动，有明显的生防效果。木霉菌，属于丛梗孢目，丛梗孢科，是常见于土壤中、植物残体、植物的根围、叶围、 种子、球茎表面及动物粪便上并对许多真菌有拮抗作用的丝状真菌。木霉的菌落生长迅速， 呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多呈绿色，木霉能产生大量孢子，其菌丝生 长及孢子萌发对温度范围和pH范围的适应性较广，且生长和繁殖快，可迅速利用营养和占 据空间10,11，是大面积植物病害生物防治最有效的真菌寄生物。大量研究表明，木霉菌的 拮抗作用具有广谱性，其对病原菌的拮抗作用机制

10、一般认为主要有抗生作用、竞争作用、 重寄生作用以及诱导抗性和协同拮抗等。自20世纪30年代发现木质素木霉(T.lig nort)n寄生于多种土传病原菌之后，人们开始 认识到木霉菌对植物病原真菌具有潜在的防治作用1。目前用于生防研究的木霉有哈茨木 霉、康氏木霉、绿粘帚霉、多孢木霉等I。其中对哈茨木霉的研究最为深入也应用较多， 如哈茨木霉防治黄瓜叶部病害的效果十分显著13，其制剂还可以用于防治灰霉病、霜霉病 和白粉病等叶部病害及果实储藏期的病害14。目前在国际上已经有50多种木霉菌制剂作为 生物农药或生物肥料进行了登记2，随着对木霉研究的加深及应用，国外已有商品化的木霉制剂问世15,如美国的Top

11、shield(哈茨木霉T22菌株)和以色列的Trichodex (哈茨木霉T39菌株)已经商品化生产16。木霉菌是一种广谱性拮抗菌，能够拮抗多种病原真菌。据不完全资料统计，木霉菌全 少对18个属29个种病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用。木霉菌对土传真菌有显著的 拮抗效果，研究比较多的是利用木霉菌防治立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)4、疫霉菌 (Phytophthora)5、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)6,镰刀菌(Fusarium spp.)7.曾华兰8研究 认为木霉菌在防治中药材土传病害方面有应用潜力。因此利用木霉防治各种植物病原物将 是今后的发展趋势

12、。以前筛选一个新的木霉菌株一般都是先到病害田的病株根际周围采集土样，分离纯化 后用典型的土传真菌病害为指示菌，做平板对峙培养或发酵液培养，然后筛选抑菌效果好 的菌株进行盆栽试验进一步观察，最后进行田间防效测定I。在实验室筛选时一般都是针 对某一种病原菌进行筛选，所筛选的菌株一般针对性强但广谱抑菌效果不好，并且筛选于 段单一，可能会漏选部分效果好的菌株。本文即是围绕木霉生物防治的主题，对分离自生态平衡性和生态多样性比较完整的九 寨沟土壤中的木霉采用平板对峙培养和无菌发酵液培养同时进行，并且是针对多种病原菌 展开生防效果研究，期待从中筛选出对植物病原菌广谱性拮抗作用较好的木霉菌株，为生 防木霉的研

13、究做铺垫。1区域概况九寨沟地处青藏高原东南边缘岷山山脉南段尕尔纳峰北麓，海拔2000-4300米。63.5%的森林覆盖率、85.5%的植被覆盖率，被誉为“物种的生命基因库”、“大自然的博物 馆” ；土壤分为9个土类，12个亚类，11个土属，26个土种，同时拥有“世界自然遗产”、“世 界人与生物圈保护区”、“绿色环球21”三项国际桂冠，生态平衡和生态多样性比较完整。2材料与方法2.1供试木霉菌株：分离自九寨沟土壤中，共10个菌株，分别编号T1T10。由四川农业 大学植物病理实验室提供。2.2靶标病原菌：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearumn Schw)、番石榴炭疽病菌(Coll

14、etotrichum gloeospoi oides Penzig )、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis (Nisikado et Miyake) Shoeml)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum Melonis)o由四川农业大学植物病 理实验室提供。2.3 培养基：PDA、PD。2.4木霉生物防治潜力的测定2.4.1木霉菌株生长速率的测定将供试木霉菌株分别接种在无菌的PDA平板上，3次重复，48 h后测定各菌株生长所 形成菌落的线性生长速度，选出5株生长速率相对较快的菌株用于拮抗试验。菌丝生长速度（cm / d）二平均菌落直径/生长时间。2.4.2对峙培养对病

15、原菌的抑制作用用对峙培养法13分析木霉对四种病原菌的拮抗作用。将木霉菌和病原菌分别置于培养 基上，25r条件下培养3d,再从不同木霉菌落的边缘和病原菌菌落的边缘切取幼嫩菌片（d=5mm）分别置于培养基的垂直平分线两端距中心点3 cm处，在26C条件下进行对峙培 养（每一处理重复3次），每天测量菌落的半径（r），以接种病原菌（非对峙培养）的生长 半径为对照，观察菌落接触界面菌丝形态及有无抑制带，计算其抑制率。抑制率的计算公式如下：抑制率=对照病原菌菌落半径-对峙培养中病原菌菌落半径对照病原菌菌落半径*%2.4.3无菌发酵培养液对病原菌的抑制作用将每瓶含100 mL PD培养液中接种等量的木霉菌丝

16、块3块，在25C黑暗条件下振荡培 养96 h，无菌脱脂棉滤取菌丝，再用无菌滤纸过滤，然后在4000 r / min离心两次，取上 清液，细菌过滤器抽滤除菌得无菌发酵液。将无菌发酵液液按1:3的比例加入冷却至50C 的PDA培养基中，制成平板。然后，将四种病原菌菌饼置于培养基的中央（直径5mm）， 每处理重复3次，用不含木霉无菌发酵液的PDA平板作对照25C下培养，每24 h测量 1次菌落半径，计算抑制率。3结果与分析3.1木霉菌株生长速度的测定由表1可以看出，木霉菌株T1，T5, T8, T9, T10的生长速度相对较快，为它们迅速 占领营养空间以及与病原菌竞争提供了天然优势，故选取这5个菌株

17、做拮抗试验。表1木霉菌株生长速度测定结果菌株编号48 h平均菌落直径（cm）生长速率/cm.d-1T14.922.46T24.052.02T34.132.06T44.282.14T54.862.43T63.911.96T73.931.96T84.912.46T94.872.44T104.622.31注：接种时菌饼直径为5 mm,生长速率采用Q值法（四舍六入五留双）进行有效计数。3.2供试木霉菌株与供试病原菌对峙培养拮抗效果将筛选出的5株生长速率较快的木霉菌株T1、T5、T8、T9、T10，分别与小麦赤霉病 菌（Fusarium graminearumn Schw）、番石榴炭疽病菌（Collet

18、otrichum gloeospoioides Penzig）、 玉米小斑病菌（Bipolaris maydis （Nisikado et Miyake） Shoeml）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum.Melonis）四种病原菌进行平板对峙试验，48 h时对峙培养拮抗效果，见表2。表2对峙培养木霉菌对四种病原菌的菌丝生长抑制率菌株小麦赤霉病菌番石榴炭疽病原菌玉米小斑病菌西瓜枯萎病菌平均抑制率（）平均抑制率（）平均抑制率（）平均抑制率（）T133.91Cc26.89Dd18.72Bb18.64CcT540.23Bb32.77Cc23.29 ABb27.24BbT858.33

19、Aa54.90Bb44.29 Aa60.22AaT960.06Aa63.31Aa26.03 ABb3.23EeT1034.77Cc23.25Ee19.18 Bb7.17Dd注：小写字母代表显著水平r=0.05，大写字母代表显著水平R=0.01。从表2中各处理平均抑制率的差异显著性检验结果表明，所有菌株均对四种病原菌表 现出一定的拮抗效果，其中T8表现最强势，T8对西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、番石榴炭 疽病菌、玉米小斑病菌的抑制率分别为60.22%、58.33%、54.90%、44.29%，在供试的5株 菌株中表现出最好的广谱性抑制效果；其次丁9对番石榴炭疽病菌、小麦赤霉病菌的拮抗效 果也很明显

20、，其抑制率分别为63.31%和60.06%，但对玉米小斑病菌为26.03%，西瓜枯萎病 菌的抑制率只有3.23%,广谱性不如丁8好。其它几只菌株对四种病原菌的抑制率都在40.00% 以下，拮抗效果不是很明显。3.3供试木霉菌无菌发酵培养液对供试病原菌拮抗效果48h时筛选出的5株木霉菌无菌发酵液对四种病原菌的拮抗效果，见表3。表3木霉菌无菌发酵培养液对四种病原菌的抑制率小麦赤霉病病原番石榴炭疽病菌玉米小斑病病原西瓜枯萎病病原菌株菌菌菌平均抑制率（）平均抑制率（）平均抑制率（）平均抑制率（）T142.82Dd35.85Dd11.42De21.15EeT549.43Cc16.25Ee25.57Cc2

21、9.03DdT852.87Bb50.98Bb52.51Aa67.38AaT964.37Aa65.83Aa20.09Cd42.65CcT1052.87Bb42.30Cc32.42Bb54.12Bb注：小写字母代表显著水平r=0.05，大写字母代表显著水平R=0.01。5株供试木霉菌株对四种病原菌的发酵培养液培养结果表明，所有菌株均对四种病原 菌表现出一定的拮抗效果，与对峙培养相比较T8、T9、T10的广谱抑制效果都有所提升， 其中T10的提升效果最明显，但是T1的广谱抑制效果有小幅的下降。从整体上比较T8的广 谱抑制效果依然是最好的，对西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、玉米小斑病菌、番石榴炭疽 病菌的

22、抑制率分别为67.38%、52.87%、52.51%和50.59%；其次T9的表现也很突出，对番石 榴炭疽病菌和小麦赤霉病菌，以及西瓜枯萎病菌的抑制率也分别达到65.83%、64.37%和 42.65%；同时T10的抑制效果也有所加强，它对西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌的抑制率也 分别大到了 54.12%和52.87%。4结论与讨论木霉菌种类较多，广泛存在于自然界中，常见于土壤中、植物残体、植物的根围、叶 围、种子、球茎表面及动物粪便上，由于木霉的菌落生长迅速，能产生大量孢子，其菌丝 生长及孢子萌发对温度范围和pH范围的适应性较广，且生长和繁殖快，可迅速利用营养和 占据空间10,11使其在植物病害

23、生物防治中被广泛地研究和利用，具有很强的抗菌防病作 用。经过对峙培养和发酵液培养结果表明，从九寨沟采集回的若干土壤标本中分离纯化后 筛选的5株木霉菌，对四种植物病原菌均有一定程度的拮抗作用，只是程度的大小不同， 其中T8菌株的广谱拮抗效果最好，在两种培养方法中对四种病原菌的抑制率在44.29%和 67.38%之间；另外T9也表现出很好的拮抗效果，对番石榴炭疽病菌和小麦赤霉病菌抑制率 分别达到65.83%和64.37%，因此可以看出T8和T9具有较强的生防潜力，在植物病害生物防 治的应用中可行性很高，具有广阔的前景。但是本次试验均在实验室条件较理想的环境下 进行的，并且在试验时仅选用了四种病原菌

24、做测定，且整个局限性较大。根据本文研究结果还发现，对于广谱性抑菌效果较好的木霉菌株，用发酵液培养比用 对峙培养对病原菌的广谱性抑制效果更好，并且针对单一病原菌的抑制率也都部分提高， 例如T8和T9菌株；T1菌株用发酵液培养比用对峙培养对病原菌的广谱性抑制效果更差， 针对单一病原菌的抑制率也部分下降；同时也发现，T5菌株用上述两种方法培养时，对不 同的病原菌拮抗效果不成统一的上升或下降趋势。因此提醒我们在筛选、评价一个木霉菌 菌株时，应当从多方面入手，创新筛选手段，综合考虑各种机制的协同作用以及外界生态 因素的影响，充分发掘木霉在生防领域的潜力。参考文献1 于新，田淑慧，徐文兴，等.木霉菌生防作

25、用的生化机制研究进展J.中山大学学报(自然科学版).2005，44(2)： 86-90.2 陈捷.木霉菌在植物病害生物防治中的作用机理研究进展.迈入二十一世纪的中国生物防治.2005， 70-76.3 徐同，钟静萍.木霉对土传病原真菌的拮抗作用J.植物病理学报，1993, 23 (1)： 63-67.4 田连生，石万龙，杨迎霞，等.木霉对腐霉菌的拮抗机制及生防效果研究J.河北省科学院学报，2001， 18 (2)： 114-117.5 胡东维，王源超，徐颖.木霉对辣椒疫霉菌抑制作用的超微结构与细胞化学J.菌物系统，2003， 22(1)：95-100.6 燕翩皇，陆德清.木霉拮抗整齐小菌核菌株

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29、om research onTrichoderma harzianum T-22J.Plant Disease,2000, 84(4):377-393.17 Whipps J M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphereJ. Journal of Experimental Botany,2001,52(roots special issue):487-511.致谢本论文是在导师龚国淑教授的悉心指导下完成的，从选题、实验设计、准备直至最后 定稿，整个过程都凝聚了导师大量的心血和精力。龚老师严谨谦虚的治学态度，无私奉献 的敬业精神和宽容礼让的人品风貌都对我产生了深远的影响，使我受益匪浅，是我终身学 习的典范。在此论文完成之际，我谨向龚老师致以崇高的敬意，并表示衷心的感谢！在本次实验和论文撰写过程中，得到了周游师兄的大力支持和帮助，在此特向致以诚 挚的谢意！