埃博霉素生物合成.ppt

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1、埃博霉素 （Epothilones）,埃博霉素（ Epothilones ）是一种天然产物，1993年由德国生物技术研究公司的科学家Hofle从降解纤维素的粘液菌，纤维堆囊菌的培养液中分离得到，最开始作为抗真菌药和杀虫剂研究，但对植物的毒性太大。 1995年，美国Merck公司的科学家也独立地分离得到了埃博霉素，并且惊奇地发现这些化合物能够杀死肿瘤细胞，其作用机理与紫杉醇的机理相似，能够促进微管蛋白的聚合，形成稳定的细胞微管，抑制癌细胞的分裂，从而导致癌细胞死亡，后来这一重大发现也被Hofle等证实。,Epothilones,Epothilones,紫杉醇在治疗卵巢癌、肺癌、头颈部癌症和其他癌

2、症均表现出不凡的疗效，市场总销售额已超过200亿。但是，紫杉醇生物利用度差、副作用严重，寻找具有微管稳定功能又不具这些缺点的“后紫杉醇药物”成为研究热点。在多种药物的筛选中埃博霉素抗癌活性最理想。,埃博霉素对许多药物治疗效果不稳定的癌细胞以及多药配伍易产生抗药性的癌细胞也具有高活性，表现出对紫杉醇及其它抗癌药物有耐药性的癌细胞具有优异的疗效；一些全合成的埃博霉素同系物不仅能够抑制恶性肿瘤的增长，而且能使其萎缩，甚至消失，并维持很长的时间不再复发，这种优异的抗癌活性在抗癌药物中是极其少见的。 水溶性比紫杉醇更好，便于配制和使用；此外，埃博霉素不仅可以通过发酵的方法大量制备，由于结构相对简单，也容

3、易通过全合成得到，以及进行化学修饰，得到其它衍生物，这对于进一步的药物筛选非常用。 紫杉醇现有资源破坏严重，后续资源不足，埃博霉素可能是更为理想的替代。,Enter your title here,结构,埃博霉素是一类16元环的大环内酯化合物，在15位置连接了一个含噻唑环的侧链。 由发酵制备时，埃博霉素和是主要产物，埃博霉素是次要产物，但可以经一步反应从或者得到。 埃博霉素、和对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素，其活性比紫杉醇强10-100倍在12位上的有甲基取代，以及12-13双键换成环氧基团后，埃博霉素的活性将极大提高。,A: R=H B: R=Me,C: R=H D

4、: R=Me,E: R=H F: R=Me,埃博霉素作为极其有潜力的抗癌新药，引起了全世界的化学家、生物学家及药学家的极大兴趣和研究热情。从1993年发现至今十多年时间，有关埃博霉素的研究报告达500多篇，天然的埃博霉素和已经进入了临床期试验，化学合成的埃博霉索内酰胺已经进入了临床期试验。,Enter your title here,如果说紫杉醇从发现到成为药品上市经过了二十多年的时间，埃博霉索成为临床用药可能只需要十多年的时间。,发酵是大规模生产的理想途径，不似有机合成的繁琐，并有望提高产量，也能改变埃博霉素累化合物的种类，产生多种埃博霉素类似物。筛选更广泛的埃博霉素产生菌是一条有效的途径，

5、埃博霉素发酵的提升潜能还很大。但高产菌株难获得，生产周期长。现有的生物合成体系用于大规模生产仍有一定局限性。,全合成 生物合成,埃博霉素结构较紫杉醇简单化学合成备受关注。埃博霉素一问世，就相继报道了数十条全合成路线。目前全 合成的方法不下30种，但具有商业价值的全合成方法必 须具备合成步骤短、杂质片段少、总产率高这个优势。目前全合成埃博霉素步骤冗长，产率低，全合成生产仍在逐步完善。,合成,埃博霉素B内酰胺衍生物的半合成,埃博霉素B内酰胺衍生物埃博霉素D埃博霉素B埃博霉素A紫杉醉,（亚硝基胍）诱变 选育埃博霉素高产菌株,发酵生产埃博霉素B,化学结构修饰,埃博霉素B内酰胺,美国施贵宝公司的埃博霉素

6、B内酰胺衍生物（“依沙匹隆”）规格45mg/支批发价为2765.89美元,Enter your title here,菌种诱变,取纤维堆囊菌于5mL G52培养基培养48，离心收集菌体，用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤两次，然后重悬于mLpH6.0的磷酸缓冲液中，制成菌悬液。 取NTG母液，加入菌悬液中，配制成各浓度的含NTG的菌悬液，在不同温度下进行诱变处理30min。将菌悬液4离心，用冷无菌水洗涤次以终止诱变。 加入相同体积的52液体培养基，30，180rpm培养1.5h，渡过生理延时期。将诱变后的菌液用无菌生理盐水十倍稀释，涂于VY/2平板，30，培养-。,G52培养基 ：酵母粉2gL，Mg

7、SO47HO1gL，CaCl2HO1gL，脱脂奶粉 2gL，马铃薯淀粉8g/L，无水葡萄糖2gL，EDTA铁钠 8mg/L，KOH 调 pH 至 7.4 VY/2 固体培养基 ：酵母提取物5g/L,CaCl22H2O1gL，VB120.5mgL，Agar15L，KOH调pH至7.2,Enter your title here,正突变菌初筛,取直径1-2mm的单菌落接种于G52液体培养基，30、180rpm振荡培养d，接入1B12发酵培养基。6后，于培养平板上放置牛津杯，在杯中加发酵液。每个平板上都有一个原种的发酵液作为对比，平板上涂有古巴号AS2.1189.5酿酒酵母。,正突变菌复筛,2-3后

8、挑选有蓝色抑菌圈且抑菌圈大于原种的菌落，于G52液体培养后，再接于1B12培养基中发酵培养，最后取发酵液16000rpm，min离心后取上清液通过高效液相色谱检测产物峰。 色谱条件：色谱柱：AgilentXDB-18，2004.6；柱温：30；检测：250nm，UV-DAD；流动相：磷酸-乙腈溶液。,Enter your title here,分析选取高产菌株,将标准品EpothilonesB 溶于色谱纯的甲醇溶液，配制成一系列浓度，分别为：5ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、50ug/mL。使用HPLC检测标准样，进样量为20uL，每个浓度进样三次以保证数据的正确性。同时使用色谱纯

9、甲醇进行空白对照。 埃博霉素的出锋时间在16min左右，将各个浓度所得的数据汇总，以浓度为横座标，锋面积为纵坐标绘制标准曲线。,比较复筛菌液上清的出峰时间是否与标准品一致，已确定结果是否可信。利用样品峰面积和标准曲线方程求算产物浓度，并与原种比较，选取最优菌株。,Enter your title here,发酵,取选出的高产菌株接种于500mL 1B12培养基，加入吸附树脂（XAD-16），发酵培养6d。将发酵液过滤得树脂，纯水洗涤2次，加10ml甲醇洗脱。减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯抽提，减压蒸干。,Enter your title here,化学修饰,埃博霉素B（98g，199.4mmol） 叠氮钠（15.54g，24mmol） 悬浮于THF-H2O（5：1）2L，氮脱气20min，加三苯基膦钯在氩气环境下45催化反应1h，冷至25 。加1M三甲基膦-THF450ml，搅拌2h。用HOBT（27g）和EDCL（95.6g）处理，搅拌12h。 乙酸乙酯萃取，有机层用水及盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得产品。,脱环氧基形成双键 埃博霉素D内酰胺,埃博霉素B内酰胺,The End Thank You,