色谱分离技术

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1、第七章色谱分离技术 随着科学的进步，某些关系到人们生命安全的生物药品，尤其是注射药品和生物工程产品等，都需要高度纯化。但是，经典的分离方法（如萃取、结晶等）很难满足需要。色谱法应运而生。产生的必然性 色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离技术。是产品的最后纯化工序（精制），即在用色谱纯化之前需要经过其他方法进行提取和初步纯化。近40年来，色谱技术已成为生物大分子分离和纯化技术中极重要的组成部分。胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长激素等。概述 化学分析方法的基本要求是其选择性要高。即，在分析过程中，待测物与潜在的干扰物的分离是最为重要的步骤！20 世纪

2、中期，大量采用一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取。现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。1903年，俄国植物学家MikhailTswett 最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素chlorophylls&xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱(希腊语中“chroma”=color;“graphein”=write)。20世纪世纪50年代，色谱发展最快（一些新型色谱技术的发展，复杂组分分析发展的要求）。色谱法的发展历史

3、年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1

4、952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代年代获奖学科获奖学科

5、获奖研究工作获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究色谱分离基本原理：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上、与流动相互不

6、相溶的固定相表面。处于柱起始端的样品中各组份与两相进行不同程度的作用。与固定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，而与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快。由于流出的速度的差异，使得混合组份最终形成各个组份的“带(band)”或“区(zone)”，对依次流出的各个组份物质可分别进行定性、定量分析。色谱分类方法按照分离过程中相系统的形式和特征，可分为：柱色谱法 填充柱色谱法 毛细管色谱法平板色谱法 纸色谱法 薄层色谱法按流动相，可分为：气相色谱法 液相色谱法超临界色谱法按固定相物态，气相色谱法可分为：气固色谱法 气液色谱法按流动相物态，液相色谱法可分为：液固色谱法 液液色谱法柱色谱法的分类见表8

7、-1。按色谱动力学过程，可分为：洗脱色谱顶替色谱迎头色谱洗脱色谱(a)、顶替色谱(b)、迎头色谱(c)按组份在固定相上的物理化学原理，分为：吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换 剂）上的亲和力不同；凝胶色谱:（尺寸排阻色谱）：不同尺寸分子在固 定相上的渗透作用；色谱法的特点1 分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。2 灵敏度高 可以检测出10-1110-13g的物质量。3 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。4 应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机

8、试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。概述吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法高效液相色谱法亲和色谱法 一、概述 1.发展史创始人：茨维特（Tsweet）1906菊根粉或碳酸钙石油醚连续色带色层或色谱色谱法得名纸色谱薄层色谱气相色谱高效液相色谱离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱植物色素的石油醚提取液 2.色谱法的特点 （1）概念 色谱法是一种物理的分离方法，利用不同物质在两相中具有不同的分配系数，并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法。其中一相是固定相，通常是表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。流动相流经固定相时

9、，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离；或者说，易分配于固定相中的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而逐步分离。（2）基本特点：分离效率高。其效率是所有分离纯化技术中最高的，这种高效的分离尤其适于极复杂混合物。应用范围广。（非）极性、（非）离子型、小分子和大分子、无机和有机及生物活性物质、热（不）稳定化合物；尤其是对生物大分子的分离，其他方法无法取代。选择性强。可变参数很多：不同的色谱分离方法、固定相和流动相、操作条件。设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件，因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子有机化合物。缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操

10、作，因此主要用于实验室，工业生产上应用较少。3.色谱法的分类分离机理操作方法流动相的物态实验技术吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法柱色谱法纸色谱法薄层色谱法气相色谱法液相色谱法迎头法顶替法洗脱分析法 4.色谱分离方法的选择初级代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸次级代谢产物：生物碱、萜类、糖苷、色素、鞣质类、抗生素生物大分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖目的产物 色谱分离方法的选择依据：目的产物的分子结构、物理化学性质及相对分子质量；主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质成分与含量；目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳定性。二、吸附色谱法

11、 依靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附剂是一些多孔性物质，表面布满许多吸附位点，即活性中心。吸附色谱过程就是样品中各组分的分子与流动相分子不断争夺吸附剂活性中心并不断达到平衡的过程。被吸附的物质称为吸附物。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。（一）基本原理 溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。1.发生吸附作用的原理：固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子）所处的状态不同：固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处于平衡状态。界面上的分子所受的力不对称，作用力

12、总和不等于零，合力指向固体内部。2.吸附的类型：物理吸附化学吸附交换吸附物理吸附 化学吸附产生方式分子力（范德华力）库仑力(电子转移，生成化学键)活化能低高进行温度低温高温释放热量小很大速度较快，容易达到平衡慢，平衡慢选择性不严格强 交换吸附：吸附剂表面如果由极性分子或离子组成，则会吸引溶液中带相反电荷的离子形成双电层，同时放出等物质的量的离子，发生离子交换。离子的电荷是决定因素，离子所带电荷越多，在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力越强。电荷相同的离子，水化半径越小，越容易被吸附。3.常用的吸附剂：有机吸附剂：无机吸附剂：活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺 氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙、氢

13、氧化铝按化学结构分 4.吸附色谱的基本过程和分类 固定相对各组分吸附力的大小次序：（1）过程（2）分类吸附薄层色谱法柱色谱法操作方法的不同 5.吸附薄层色谱法 （thin layer chromatography,TLC）薄层色谱法：将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上，铺成一薄层，然后把要分离的样品点到薄层的起始线上，用合适的溶剂展开，最后使样品中各组分得到分离。（1）原理：利用混合物中各组分的物理化学性质的差异，在层析过程中，在不相溶的两相中分布不同，从而达到分离的目的。吸附剂：涂布在薄层板上（固定相）展开剂：在展开过程中流过固定相的溶剂 （流动相）两相 将待分离的样品溶液点在薄层板的一端，

14、在密闭的容器中用适宜的溶剂（展开剂）展开。当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同：对极性大的物质吸附力强，对极性小的物质吸附力弱。移动速度的不同：易被吸附的物质相对移动较慢，在薄层板上移动的距离就小；较难被吸附的物质移动较快，移动的距离大。经过一段时间的展开，不同物质就被彼此分开，最后形成互相分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，用特定的方法使斑点显色，达到定性和定量的目的。（2）吸附剂和展开剂的选择：吸附剂：氧化铝、硅胶和聚酰胺 展开剂：由实验确定。极性越大，对物质的洗脱能力越强 （3）基本操作

15、 薄层色谱板的制备点样展开显色 薄层板的制备：在一块玻璃板（薄厚一致，表面光滑平整）表面涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等。(-涂布)为了增加薄层的牢固性且易于保存，可在涂布过程中加入某些黏合剂。如羧甲基纤维素钠（CMC-Na）点样：用毛细管吸取样品溶液，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上。1.5 2 cm直径 3 mm 展开：在密闭容器中进行：层析缸。最常用的展开法：上行展开法 薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。当溶剂移动到接近薄板上端边缘时，取出薄板，划出溶剂前沿。显色：也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物各组分斑点呈现颜色。每类化合物都有特定的显色剂。各类物质常用的显色

16、剂和万能薄层显色剂 显色的方法：喷雾显色法紫外线照射法碘蒸气显色法生物显迹法有些化合物在紫外灯下会产生荧光或暗色斑点在充满碘蒸气的容器中，多数天然药物成分会产生棕色斑点抗生素等生物活性物质每类化合物都有特定的显色剂 6.吸附柱色谱法 （1）基本原理同薄层色谱法。吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、活性炭（2）色谱柱：玻璃柱 （3）基本操作装柱上样洗脱吸附剂干法装柱湿法装柱被分离物质干法上样湿法上样梯度洗脱，各组分先后被洗出 三、分配色谱法 分配色谱法：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而进行分离的方法。分配色谱法：利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分布情况不同而使混合物得到分离

17、。（相当于一种连续性的溶剂提取方法，只是把其中一个溶剂设法固定，用另一种溶剂来冲洗，这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂的提取而完成，所以叫。）（一）基本原理固定相：固定在柱内的液体流动相：用作冲洗的液体载体：使固定相停留在柱内的固体 在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动慢，因此得到分离。（溶解度）将含固定相的载体装在柱内加入被分离溶液洗脱分离：（二）载体、固定相和流动相的选择1.载体的选择 惰性、无吸附能力、能吸留较大量固定相。主要有硅胶、硅藻土、纤维素，聚乙烯粉2.固定相的

18、选择 水、缓冲液、酸的水溶液“反相层析法”：有机溶剂作固定相3.展开剂的选择 （三）基本操作装柱上样洗脱 四、离子交换色谱法 与离子交换法的区别？离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。离子交换树脂 组成 活性离子 离子交换色谱法的固定相应该是什么？离子交换色谱法：利用离子交换树脂作为固定相，以适宜的溶剂作为流动相，使溶质按它们的离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离方法。基本原理：带电物

19、质因电荷力作用而在固定相和流动相之间分配得以相互分离。两性电解质（蛋白质、氨基酸）在不同溶液中所带的净电荷的种类和数量不同：pH=pI;pH pI?溶液pH偏离pI越远，则净电荷量越大。由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们分离。离子交换树脂（固定相）的性质、种类、选择依据、离子交换色谱的操作及应用 五、凝胶色谱法 凝胶色谱法：以凝胶为固定相、基于分子大小不同而进行分离的一种方法。因其整个过程和过滤相似，又称凝胶过滤、分子筛过滤等。凝胶：一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一

20、个筛子。利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不同从而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。（一）原理小分子（二）凝胶过滤介质基本要求：u 不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用u 高物理强度、高化学稳定性u 耐高温高压、耐强酸强碱u 高化学惰性u 内孔径分布范围窄u 颗粒大小均一度高常用的凝胶过滤介质葡聚糖凝胶琼

21、脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶 1.葡聚糖凝胶 应用最广泛的一类凝胶。u 由葡聚糖Dextran交联而得。在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度不同的凝胶。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫做交联度。交联度大：网状结构紧密，吸水量小 交联度小：网状结构疏松，吸水量多u 化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液 2.琼脂糖凝胶u 来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，而是以氢键交联，键能较弱。u 孔隙度通过改变琼脂糖浓度而达到（与葡聚糖不同）（联系琼脂糖凝胶电泳）u 化学稳定性：琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶u 没有干胶，必须在溶胀状态保存。u 能分离几万至几千万高相对分子质量的物质，

22、分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。适用于核酸、多糖和蛋白质类物质的分离。3.聚丙烯酰胺凝胶u 人工合成，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。u 对芳香族、杂环化合物有不同程度的吸附作用。（三）操作方法凝胶的预处理层析柱的选择凝胶柱的装填样品处理和加样洗脱与收集凝胶的保存1、凝胶的预处理：充分溶胀2、层析柱的选择 体积 柱比：层析柱的长度与直径的比 （样品的数量、性质、分离目的）3、凝胶柱的装填 进胶过程宜连续、均匀、不中断，并不断搅拌。4、样品处理和加样（样品的浓度、黏度）5、洗脱与收集（洗脱液的成分、流速、目的物）6、凝胶的保存（去除杂质）六、高效液相色谱法(High pe

23、rformance Liquid chromatography,HPLC)高效液相色谱法：特指一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱的基础上，引入了气象色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。（一）HPLC的分类和基本原理 固定相液-液色谱液-固色谱作用原理液-固吸附色谱液-液分配色谱凝胶渗透或体积排除色谱离子交换色谱亲和色谱1.液-固吸附色谱 流动相液体 固定相固体吸附剂（活性吸附剂）分离机制：被分离的组分分子（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表面活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。与薄层色谱在分

24、离机理上有很大的相似性，主要按样品极性的大小进行分离。2.液-液分配色谱 流动相液体 固定相载体+固定液 以液体为流动相，把另一种液体涂渍在载体上作为固定相。分离机制:流动相与固定相互不相溶，两者之间有一明显的分界面，样品各组分借助于它们在两相间的分配系数的差异而获得分离。（与液-液萃取的机理相似）3.离子交换色谱 流动相液体 固定相人工合成的离子交换树脂 分离能在溶液中电离的样品。4.凝胶渗透或体积排除色谱（凝胶色谱）流动相液体 固定相多孔凝胶 近似于分子筛效应，样品按分子大小不同进行分离。5.亲和色谱 利用生物大分子与某些对应的专一分子有特异的亲和力将混合物进行分离。用于分离任何两种有特异

25、性相互作用的生物大分子。（二）高效液相色谱仪高压输液系统进样系统分离系统检测系统辅助装置：自动进样、数据处理主要部分2.进样系统 进样器是供样品进入色谱柱的通道1.高压输液系统 高压泵是高压输液系统的核心部件，是高效液相色谱的动力部件，用它来完成流动相和试样的输送，使其以恒定的流量流经色谱柱。3.分离系统色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，由色谱柱管和固定相两部分组成。4.检测系统 将色谱柱流出物中样品含量的变化转变为可供观测的信号（通常是电信号），以便自动记录下来。这种电信号又称为色谱图。应用较多的：紫外检测器、荧光检测器、二极管阵列检测器等（三）应用实例 HPLC测胆固醇含量鉴别地沟油 原

26、理：餐厨废油脂中的地沟油是多种动、植物油脂的混合物，其中含有大量的动物油脂，动物油脂中含有胆固醇，植物油中一般不含或只含极少量的胆固醇。利用HPLC测定油中胆固醇含量来分析是否掺了废油脂。七、亲和色谱法 亲和色谱法：利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种色谱方法。如抗原与抗体，酶与底物，激素与受体等 广泛用于酶、抗体、核酸、激素等的分离与纯化，特别是对含量极少而又不稳定的活性物质最有效。（一）基本原理 亲和色谱是应用生物分子对它的互补结合体（配基）的生物识别能力，使目标产物得以分离纯化的液相层析法。配基的固定化吸附样品样品解析（洗脱）具有亲和力的两个分子中的

27、一个（配基）以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂样品（流动相）流经层析柱时，配基选择性吸附目的分子，杂质不能被吸附而流出。选择适宜的条件将被吸附的目的分子洗脱配基载体亲和层析亲和物杂质+洗涤洗脱再生（二）亲和吸附剂的制备载体的选择配基的选择载体的活化与偶联1.载体的选择 具有较好的理化稳定性和生物惰性 具有大量可供活化和配基结合的化学基团 高度的水不溶性和亲水性 有稀松的网状结构使大分子能自由进入 有良好的机械性能，颗粒均匀 2.配基的选择 特殊配基 抗原的抗体，酶的专一抑制剂，激素的受体 通用配基 可适于一类物质的分离提纯 3.载体的活化与偶联 载体具有惰性 先活化再与配基偶联 活化

28、的作用：载体表面活化后产生的活性基团可在简单的化学条件下与配基上的氨基、羧基、羟基或醛基等发生共价结合（三）影响吸附亲和力的因素配基浓度：高空间障碍：在载体与配基之间插入多烃链“手臂”配基与载体的结合位点载体孔径（四）操作方法具有亲和力的一对分子中的一个作为配基，与不溶性载体结合，使之固化，装入色谱柱含目的物的混合液作为流动相进入色谱柱，配基选择性吸附目的物质，杂质不能被吸附而直接流出。改变条件使配基与其亲和物解离亲和层析的基本过程：具体操作：样品制备含杂质，需预处理：配体与配基结合条件的选择pH、缓冲液浓度、离子强度 柱操作 流速的控制 清洗 洗脱 柱的再生蛋白沉淀、离子交换柱层析柱的大小、

29、长短高速度、高效率除去不结合的所有物质特异性洗脱（竞争性置换目的物）非特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）（五）亲和色谱法的应用 1.亲和色谱法的特点：专一、高效、简便、快速 2.应用 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离以下物质：杂质与目的物间的溶解度、分子大小、电荷分布等性质差异小，相对含量低，其他经典手段分离有困难的高分子物质；尤其是对分离某些不稳定的高分子物质更具有优越性。如：酶、rRNA、抗原和抗体的分离，激素的提纯 分离纯化各种功能细胞、细胞器、膜片段和病毒颗粒 用于各种生化成分的分析检测 与亲和色谱有关的特殊技术应用 吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法高效液相色谱法混合物随流动相通过固定相时，由于固定相对混合物中各组分的吸附能力不同对其分离固定相和流动性都是液体，根据混合物中各组分在两相中的分配系数不同而分离。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而进行分离以凝胶为固定相，依靠各物质的分子大小和形状不同对混合物进行分离利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性对其进行分离课堂总结气相色谱系统 记录仪色谱处理机气体钢瓶色谱主机空气压缩机气相色谱仪整机气相色谱整机钢瓶与减压阀氮气氢气气相色谱仪主机控温柱室色谱电路控制气相色谱仪柱室控温柱室控温方式：恒温或程序控温