chap6微生物的生长及其控制

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1、00.511.522.500.20.40.60.81OD值活菌数（亿个/毫升）图示 假单胞菌OD值和活菌数的关系其原理是菌悬液中的单细胞微生物，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度(或透光度)或浊度可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。2 生理指标法（1）DNA 测定法测定法 这种方法是基于 DNA 与 DABA 2HCl(即新配制的 20 W W，3,5 二氨基苯甲酸-盐酸溶液)结合能显示特殊荧光反应的原理，定量测定培养物的菌悬

2、液的荧光反应强度，求得 DNA 的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据 DNA 含量计算出细菌的数量。每个细菌平均含 8.4 10-5 g DNA。（2）其他生理指标测定法）其他生理指标测定法 用某物质的消耗量或某产物的形成量来表示微生物的生长量。例如通过测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或 CO 2 的释放量，均可用来作为生长指标。使用这一方法时，必须注意作为生长指标的那些生理活动，应不受外界其他因素的影响或干扰，以便获得准确的结果。微生物生长测定方法比较微生物生长测定方法比较测定细胞数目测定细胞数目方法方法特点与应用特点与应用总细胞数总细胞数血球计数板法血球计数板法 较快速简便

3、，但较费时较快速简便，但较费时活细胞数活细胞数 平皿菌落计数法平皿菌落计数法 简易价廉，但花费时间较长，不能立刻知道结果简易价廉，但花费时间较长，不能立刻知道结果薄膜过滤平皿法薄膜过滤平皿法 灵敏度高灵敏度高,不用于高密度培养物，不能立刻知道结果不用于高密度培养物，不能立刻知道结果测定物质量测定物质量比浊法比浊法 快速简便，敏感度低，适于不发酵液或液体中的快速快速简便，敏感度低，适于不发酵液或液体中的快速 总细胞数估计，但需事先标定总细胞数估计，但需事先标定细胞湿重法细胞湿重法 较为简便，但含水量不定，准确度差较为简便，但含水量不定，准确度差细胞成分含量法细胞成分含量法 如测定蛋白质、核酸、还

4、原糖的含量等如测定蛋白质、核酸、还原糖的含量等细胞干重法细胞干重法 较为费时，易受颗粒杂质干扰，敏感度低较为费时，易受颗粒杂质干扰，敏感度低微生物的生长表现在微生物的个体生长与群体生微生物的生长表现在微生物的个体生长与群体生长两个水平上。长两个水平上。微生物个体生长微生物个体生长表现为个体质量和体积的增加。表现为个体质量和体积的增加。微生物群体生长微生物群体生长是以微生物细胞的数量或微生物是以微生物细胞的数量或微生物群体细胞物质量的增加作为生长的指标。群体细胞物质量的增加作为生长的指标。因而要了解微生物的生长规律，就要了解微生物因而要了解微生物的生长规律，就要了解微生物的个体生长和群体生长两个

5、方面。的个体生长和群体生长两个方面。单细胞微生物个体生长表现为细胞体积的增加单细胞微生物个体生长表现为细胞体积的增加 和细胞内物质含量的增加两个方面和细胞内物质含量的增加两个方面,当细胞生当细胞生长到一定时期，就分裂成为两个子细胞。长到一定时期，就分裂成为两个子细胞。多细胞微生物个体生长则反映在构成个体的细多细胞微生物个体生长则反映在构成个体的细胞数目增加和每个细胞个体生长两个方面。胞数目增加和每个细胞个体生长两个方面。微生物的个体生长 化学诱导物理诱导诱导法诱导法过滤法区带密度梯度离心法膜洗脱法筛选法筛选法同步培养法同步培养法 获得同步生长的方法主要有两类：获得同步生长的方法主要有两类：环境

6、条件诱导法：变换温度、光线、环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。理方法，随机选择，不影响细胞代谢。生长曲线的制作生长曲线的制作：接种接种适温培养适温培养定时取样测定时取样测定生长量定生长量将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增

7、长数测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。影响延滞期长短的因素与实践意义影响延滞期长短的因素与实践意义接种龄接种龄:对数期对数期“种子种子”，延滞期较短，延滞期较短；延滞期或衰亡期延滞期或衰亡期“种子种子”,延滞延滞期期 较长；较长；接种量：接种量：接种量大，延滞期较短；接种量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长；接种量小，延滞期较长；培养基成分培养基成分:培养基成分丰富的，延滞期较培养基成分丰富的，延滞期较 短；短；培养基成分与种子培养基一致培养基成分与种子培养基一致,延滞期较短；延滞期较短；现象：活菌数没增加，曲线

8、平行于横轴。现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。原因：适应新的环境条件，合成新的酶，原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。积累必要的中间产物。影响指数期的因素影响指数期的因素菌种：菌种：不同菌种的代时差异极大不同菌种的代时差异极大 营养成分：营养越丰富，代时越短营养成分：营养越丰富，代时越短 营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率培养温度：影响微生物的生长速率指数期的实践意义指数期的实践意义 是代谢、生理研究的良好材料是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄是增殖噬菌体的最适宿主菌龄

9、是发酵生产中用作是发酵生产中用作“种子种子”的最佳种龄的最佳种龄 G G+染色鉴定时采用此期微生物染色鉴定时采用此期微生物 不同温度下的代时不同温度下的代时 温度对微生物的代时有明显影响：温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli E.Coli 在不同温度下的代时在不同温度下的代时温度（温度（）代时（分）代时（分）温度（温度（）代时（分）代时（分）1010 860 860 35 35 22 22 15 15 120 120 37 37 17 17 20 20 90 90 40 40 17.5 17.5 25 25 40 40 45 45 20 20 30 30 29 29 47.5 47.5

10、77 77三）稳定期三）稳定期特点：特点：活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点。衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点。细胞生长速率为零细胞生长速率为零细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢。成分合成缓慢。为什么细胞总数不再增加？为什么细胞总数不再增加？营养物质被消耗不能满足生长需要营养物质被消耗不能满足生长需要 代谢废物或有害物质积累到抑制生长水平代谢废物或有害物质积累到抑制生长水平 pH、氧化还原势等物化条件越来越不适、氧化还原势等物化条件越来越不适应应稳定期的实践意

11、义稳定期的实践意义 是是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期；期；某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；故又称作代谢产物合成期；导致了连续培养原理的提出和工艺技术的导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改进。改进。四）衰亡期四）衰亡期特点：特点：细胞以指数速率死亡细胞以指数速率死亡；细胞变形退化，有的发生自溶细胞变形退化，有的发生自溶。影响衰亡期的因素及实践意义影响衰亡期的因素及实践意义与菌种的遗传特性有关与菌种的遗传特性有关:有

12、些细菌的培养经历所有的有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡各个生长时期，几天以后死亡,有些细菌培养几个月乃有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；至几年以后仍然有一些活的细胞；与是否产芽孢有关：产芽孢的细菌更易于幸存下来；与是否产芽孢有关：产芽孢的细菌更易于幸存下来；与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。长细菌培养物的存活时间。对微生物生长曲线的分析 微生物在对数生长期生长速率最快。营养物的消耗，代谢产

13、物的积累，以及因此引起的培养条件的变化，是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因。用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延迟期，加速进入对数生长期。补充营养物，调节因生长而改变了环境 pH、氧化还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长对数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。对数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵的不同时期进行收获。连续培养连续培养分批培养和连续培养分批培养和连续培养分批培养分批培养，就是指将微生物置于一定容积的培养基中，就是指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。

14、经过培养生长，最后一次收获的培养方式。连续培养连续培养，基本上说来就是在一个恒定容积的流动系统中培养，基本上说来就是在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定，即处于稳态。统中的细胞数量和营养状态保持恒定，即处于稳态。（二）连续培养类型（二）连续培养类型 连续培养技术连续培养技术恒化连续培养恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细概念：以恒定流速使

15、营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等）生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的特点：维持营养成分的亚适量亚适量，控制微生物生长，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。产

16、量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究。应用范围：实验室科学研究。连续培养技术连续培养技术恒浊培养恒浊培养概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来物流出的速度来维持菌浓度不变维持菌浓度不变,即浊度不变即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。连续培养技术连续培养技术恒浊培养恒浊培养

17、特点：基质过量，微生物特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。杂，烦琐。使用范围：用于生产大量使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乳酸、乙醇等。固定化细胞连续培养固定化细胞连续培养 细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面等将细胞固定在载体的内部或表面，加入营养，加入营养液及合适的培养条件，得到代谢产物。液及合适

18、的培养条件，得到代谢产物。优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失，优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失，反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大；只缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大；只能用于细胞分泌型产物的发酵。能用于细胞分泌型产物的发酵。连续发酵连续发酵 连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：优点：高效，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐高效，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；等单元操作；自控：便于利用各种仪表进行自动控制；自控：便于利用各

19、种仪表进行自动控制；产品质量稳定产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利 用率低于单批培养。用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月持数月 1年年 连续发酵连续发酵 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般连续发酵的

20、生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月只能维持数月 1 1年。年。补充：天然环境中的微生物生长补充：天然环境中的微生物生长 天然环境特点：天然环境特点：天然环境比人工条件常常要更复杂和更天然环境比人工条件常常要更复杂和更动态。动态。天然环境中微生物生长特点：天然环境中微生物生长特点：在自然环境中，微生物常在自然环境中，微生物常常合成一些人工条件下生长时所不产生的结构，如细菌常合成一些人工条件下生长时所不产生的结构，如细菌粘掖层。因为微生物细胞能够感受自然环境中发现的各粘掖层。因为微生物细胞能够感受自然环境中发现的各种化合物，其直接反应就是合成一些有用的结构和酶以种化合物，其直接反应就是合成一

21、些有用的结构和酶以便在特定的环境中生存生长。大量研究揭示，自然环境便在特定的环境中生存生长。大量研究揭示，自然环境条件下的细菌能够生长在复杂的群落中，表现出生长在条件下的细菌能够生长在复杂的群落中，表现出生长在试管中的纯培养微生物所不曾发生的某些现象。试管中的纯培养微生物所不曾发生的某些现象。（一）多重环境因子影响微生物生长的规律（一）多重环境因子影响微生物生长的规律 1 1、Liebig Liebig 最低浓度定律：即微生物总生物量由环境中满最低浓度定律：即微生物总生物量由环境中满足于微生物生长所需营养物质的最低浓度所决定。当环境足于微生物生长所需营养物质的最低浓度所决定。当环境中某种营养物

22、质被消耗饴尽或至一定浓度以下时，可使微中某种营养物质被消耗饴尽或至一定浓度以下时，可使微生物的生长停止，即使此时培养基中没有任何毒性物质存生物的生长停止，即使此时培养基中没有任何毒性物质存在，而且其他营养物质仍很丰富，当添加少量这种营养物在，而且其他营养物质仍很丰富，当添加少量这种营养物质时则微生物的生长可以重新开始。质时则微生物的生长可以重新开始。2 2、ShelfordShelford 耐受定律：当环境因子低于或高于某一个微耐受定律：当环境因子低于或高于某一个微生物不能生存或生长的阈值时，就成为生长限制因子，而生物不能生存或生长的阈值时，就成为生长限制因子，而与营养物质的供给无关。与营养物

23、质的供给无关。上述规律也适用于人工条件下的微生物生长。上述规律也适用于人工条件下的微生物生长。（二）活的但未能培养的微生物（二）活的但未能培养的微生物 很久以来，活的微生物被定义为能够活跃生长，形成菌落很久以来，活的微生物被定义为能够活跃生长，形成菌落或引起液体培养基浑浊的微生物。或引起液体培养基浑浊的微生物。然而英国科学家然而英国科学家J.R.PostgateJ.R.Postgate 首次提出了活的但未能培首次提出了活的但未能培养的微生物概念养的微生物概念,指出受自然界生境压力指出受自然界生境压力(或选择性实验或选择性实验室培养基压力室培养基压力)的微生物的微生物,对次生压力特别敏感。这样的

24、次对次生压力特别敏感。这样的次生压力作用能够产生活的微生物，但却不能够在通常用作生压力作用能够产生活的微生物，但却不能够在通常用作培养它们的培养基中生长。据估计，目前仅有大约培养它们的培养基中生长。据估计，目前仅有大约0.1%0.1%原原核微生物能够人工培养。核微生物能够人工培养。有报道指出，一些微生物即使丧失了利用标准培养技有报道指出，一些微生物即使丧失了利用标准培养技术在简易实验室培养基上生长的能力，也仍然能够在疾病术在简易实验室培养基上生长的能力，也仍然能够在疾病侵染过程中起重要作用。侵染过程中起重要作用。氧毒害厌氧菌的机制：氧毒害厌氧菌的机制：超氧阴离子是活性氧的形式之一，带奇数电子，

25、负超氧阴离子是活性氧的形式之一，带奇数电子，负电荷。它即有分子性质，也有离子性质，反应力极强，性质极不稳定。在电荷。它即有分子性质，也有离子性质，反应力极强，性质极不稳定。在体内可破坏各种重要生物高分子和膜，也可形成其他活性氧化物。在体内，体内可破坏各种重要生物高分子和膜，也可形成其他活性氧化物。在体内，超氧阴离子自由基可以自由酶促超氧阴离子自由基可以自由酶促(如黄嘌呤氧化酶如黄嘌呤氧化酶)或非酶促方式形成。或非酶促方式形成。O2+e O2 (O2).-生物体的针对措施：超氧化物歧化酶生物体的针对措施：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase-SOD)是是其中之一。其中之一。好

26、氧、耐氧微生物的超氧化物歧化酶将超氧阴离子转化为毒性稍低的好氧、耐氧微生物的超氧化物歧化酶将超氧阴离子转化为毒性稍低的过氧化氢，过氧化氢酶再将过氧化氢转化为无毒的水。厌氧微生物因过氧化氢，过氧化氢酶再将过氧化氢转化为无毒的水。厌氧微生物因为没有超氧化物歧化酶，超氧阴离子自由基可造成其损害。为没有超氧化物歧化酶，超氧阴离子自由基可造成其损害。2 O2 .-+2HSOD好氧、耐氧微生物好氧、耐氧微生物 H2O2+O2过氧化氢酶过氧化氢酶过氧化物酶过氧化物酶好氧好氧菌菌H2O+O22H2O NADH2 NAD耐氧耐氧菌菌实验证明，大实验证明，大肠杆菌的超氧肠杆菌的超氧化物歧化酶突化物歧化酶突变，就变

27、成变，就变成“严格厌氧菌严格厌氧菌”好氧微生物好氧微生物 兼性好氧微生物兼性好氧微生物 耐氧厌氧微生物耐氧厌氧微生物 厌氧微生物厌氧微生物 微好氧微生物微好氧微生物 含酶组成含酶组成catalase SOD/(低水平低水平)pH影响微生物生长机制：影响微生物生长机制：（1）介质）介质pH影响生活环境中营养物质的可给态和有影响生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性；毒物质的毒性；（2）介质）介质pH影响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳影响菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力；定性及膜对物质的吸收能力；（3）一定范围的介质）一定范围的介质pH还可造成菌体表面蛋白变性还可造成菌体

28、表面蛋白变性或水解。或水解。(一一)嗜中性微生物嗜中性微生物 生长的生长的pH范围是范围是pH5.8.0，最适生长，最适生长pH近中性近中性（pH7.0）。大多数细菌属于嗜中性微生物。）。大多数细菌属于嗜中性微生物。（二）嗜酸性微生物（二）嗜酸性微生物 最适生长最适生长pH在在5.5以下生长的微生物称之为嗜酸以下生长的微生物称之为嗜酸性微生物。性微生物。（三）嗜碱性微生物（三）嗜碱性微生物 生长的生长的pH范围是范围是pH7.011.5，最适生长，最适生长pH在在8.0以上。以上。四、水活度四、水活度嗜高渗微生物嗜高渗微生物：只能在高渗溶液中生长的微生物。：只能在高渗溶液中生长的微生物。耐高渗

29、微生物耐高渗微生物：能够忍耐高渗环境，并在高渗环境中：能够忍耐高渗环境，并在高渗环境中 生长离开了高渗环境仍然能够生长的生长离开了高渗环境仍然能够生长的 微生物。微生物。嗜盐微生物嗜盐微生物：需要在含高浓度氯化钠盐溶液中才：需要在含高浓度氯化钠盐溶液中才 能生长的微生物。能生长的微生物。温和嗜盐微生物温和嗜盐微生物:仅需要在含大约仅需要在含大约3%氯化钠的介质氯化钠的介质 中生长，如很多海洋细菌。中生长，如很多海洋细菌。极端嗜盐微生物极端嗜盐微生物：需要在：需要在9%甚至饱和氯化钠溶液甚至饱和氯化钠溶液 中生长，如某些古生菌，通常可在中生长，如某些古生菌，通常可在 饱和盐池中发现它们的踪影。饱

30、和盐池中发现它们的踪影。厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气的方法厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气的方法来实现的。实验室培养时，可将菌种接种到固来实现的。实验室培养时，可将菌种接种到固体、半固体培养基的深层进行培养，同时加入体、半固体培养基的深层进行培养，同时加入还原剂；也可将厌氧微生物放入真空干燥器，还原剂；也可将厌氧微生物放入真空干燥器，抽出空气，并充入氮气或氮气和二氧化碳的混抽出空气，并充入氮气或氮气和二氧化碳的混合气体。合气体。辐射杀菌辐射杀菌有四种类型的辐射作用有四种类型的辐射作用:紫外光、电离辐射、某种条件下的强可紫外光、电离辐射、某种条件下的强可见光、微波等，可用作控制微生物的生长和

31、保存食品。见光、微波等，可用作控制微生物的生长和保存食品。1.紫外光紫外光 200300nm范围的紫外光杀菌作用最好。范围的紫外光杀菌作用最好。杀菌作用机制：使蛋白质（约杀菌作用机制：使蛋白质（约280nm）和核酸（约）和核酸（约260nm）吸）吸收变性失活；也可产生有毒的光化学产物收变性失活；也可产生有毒的光化学产物-自由基，结合到自由基，结合到DNA、RNA和蛋白质分子上，干扰细胞的代谢过程。和蛋白质分子上，干扰细胞的代谢过程。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张或大多数其紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张或大多数其他物体，但能够在空气中传播，因而常用于消毒而不是灭菌。他

32、物体，但能够在空气中传播，因而常用于消毒而不是灭菌。主要用作物体表面或室内空气的杀菌。也有采用特殊的紫外光主要用作物体表面或室内空气的杀菌。也有采用特殊的紫外光辐射装置替代加热或漂白粉处理方法消毒像饮用水等液体。辐射装置替代加热或漂白粉处理方法消毒像饮用水等液体。2.电离辐射电离辐射 主要使用主要使用X射线和射线和射线。当射线。当X射线或射线或射线撞击分子射线撞击分子时，形成离子和自由基分子，故可称电离辐射。电离辐时，形成离子和自由基分子，故可称电离辐射。电离辐射产生射产生H2O2，使蛋白质发生变化，细胞受到损伤或死使蛋白质发生变化，细胞受到损伤或死亡。亡。电离辐射主要用于其他方法所不能解决的

33、塑料制品、电离辐射主要用于其他方法所不能解决的塑料制品、医疗设备、药品和食品的灭菌。医疗设备、药品和食品的灭菌。3.强可见光强可见光400700nm波长范围的强可见光也具有直接的杀菌波长范围的强可见光也具有直接的杀菌效应，它们能够氧化细菌细胞内的光敏感分子，如核效应，它们能够氧化细菌细胞内的光敏感分子，如核黄素和卟啉环（构成氧化酶的成分）。黄素和卟啉环（构成氧化酶的成分）。实验室应注意避免将细菌培养物暴露于强光下。此外实验室应注意避免将细菌培养物暴露于强光下。此外，曙红和四甲基蓝能够吸收强可见光使蛋白质和核酸，曙红和四甲基蓝能够吸收强可见光使蛋白质和核酸氧化，因此常将两者结合用作灭活病毒和细菌

34、。氧化，因此常将两者结合用作灭活病毒和细菌。4.微波微波微波是一种红外线。微波并不直接影响微生物微波是一种红外线。微波并不直接影响微生物,但可但可通过被辐照物体产热而杀死微生物。然而由于微波加通过被辐照物体产热而杀死微生物。然而由于微波加热食品通常存在不均匀问题热食品通常存在不均匀问题,微生物逃逸微波加热现象微生物逃逸微波加热现象常会发生。常会发生。过滤除菌过滤除菌控制液体中微生物的群体可以通过将微生物从液体中控制液体中微生物的群体可以通过将微生物从液体中移走而不是杀死的方法来实现。移走而不是杀死的方法来实现。（a）注射式微孔滤器）注射式微孔滤器 （b）小型过滤装置）小型过滤装置 （c）层流生

35、物安全柜）层流生物安全柜 图图616 常用膜滤器常用膜滤器超声波超声波 超声波:（20 000 赫兹)的声波，在多种领域具有广泛的应用。适度的超声波处理微生物细胞，可促进微生物细胞代谢。强烈的超声波处理可致细胞破碎，因此，在获取细胞内含物的有关研究中，方法之一是用超声波破碎细胞。这种破碎细胞作用的机理是超声波的高频振动与细胞振动不协凋而造成细胞周围环境的局部真空，引起细胞周围压力的极大变化，这种压力变化足以使细胞破裂，而导致机体死亡。另外超声波处理会导致热的产生，热作用也是造成机体死亡的原因之一。故在超声波处理过程中，通常采用间断处理和用冰盐溶液降温的方式避免产生热失活作用。所以几乎所有的微生

36、物细胞都被超声波破坏，只是敏感程度有所不同。杆菌比球菌、丝状菌比非丝状菌、体积大的菌比体积小的菌更易受超声波破坏，而病毒和噬菌体较难被破坏，细菌芽孢具更强的抗性，大多数情况下不受超声波影响。对微生物的杀伤或致死具有广谱性和在实践中常用的化学 消毒剂、杀菌剂和与微生物关系密切的化学疗剂及其抑菌或杀菌机制如下:1 氧化剂氧化剂 高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉和氟、氯、溴、碘及其化合物都是氧化剂。通过它们的强烈氧化作用可以杀死微生物。高锰酸钾是常见的氧化消毒剂。一般以 0.1%溶液用于皮肤、水果、饮具、器皿等消毒。但需在应用时配制。碘具有强穿透力，能杀伤细菌、芽孢和真菌，是强杀菌剂。通常用 3%7%的碘

37、溶于 70%83%的乙醇中配制成碘酊。氯气可作为饮用水或游泳池水的消毒剂。常用 0.2 0.5g/L 的氯气消毒。氯气在水中生成次氯酸，次氯酸分解成盐酸和初生氧。初生氧具有强氧化力，对微生物起破坏作用。漂白粉也是常用的杀菌剂。它含次氯酸钙，在水中生成次氯酸并分解成盐酸、初生氧和氯。初生氧和氯都能强烈氧化菌体细胞物质，以致死亡。5%20%次氯酸钙的粉剂或溶液常用作食品及餐具、乳酪厂的消毒。2.还原剂还原剂 如甲醛是常用的还原性消毒剂，它能与蛋白质的酰基和巯基起反应，引起蛋白质变性。商用福尔马林是含 37%40%的甲醛水溶液，5%的福尔马林常用作动植物标本的防腐剂。福尔马林也用作熏蒸剂，每 m 3

38、 空间用 610mL 福尔马林加热熏蒸就可达到消毒目的，也可在福尔马林中加 1/51/10 高锰酸钾使其气化，进行空气消毒。3 表面活性物质表面活性物质 具有降低表面张力效应的物质称为表面活性物质。乙醇、酚、煤酚皂(来苏儿)以及各种强表面活性的洁净消毒剂，如新洁尔灭等都是常用的消毒剂。乙醇只能杀死营养细胞，不能杀死芽孢。70 的乙醇杀菌效果最好，超过 70 以至无水乙醇效果较差。无水乙醇可能与菌体接触后迅速脱水，表面蛋白质凝固形成了保护膜，阻止了乙醇分子进一步渗入胞内。浓度低于 70 时，其渗透压低于菌体内渗透压，也影响乙醇进入胞内，因此这 2 种情况都会降低杀菌效果。酚(石炭酸)及其衍生物有

39、强杀菌力，它们对细菌的有害作用可能主要是使蛋白质变性，同时又有表面活性剂的作用，破坏细胞膜的透性，使细胞内含物外泄。5 的石炭酸溶液可用作喷雾以消毒空气。微生物学中常以酚作为比较各种消毒剂杀菌力的标准。各种消毒剂和酚的杀菌作用的比较强度，称为消毒剂的“酚价”。甲酚是酚的衍生物，市售消毒剂煤酚皂液就是甲酚与肥皂的混合液，常用 3 5 的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等。新洁尔灭是一种季胺盐，能破坏微生物细胞的渗透性，0.25 的新洁尔灭溶液，可以用作皮肤及种子表面消毒。重金属盐类重金属盐类 大多数重金属盐类都是有效的杀菌剂或防腐剂。其作用最强的是 Hg、Ag 和 Cu。它们易与细胞蛋白质结合使其变性

40、沉淀，或能与酶的巯基结合而使酶失去活性。汞的化合物如二氯化汞（HgCl 2），又名升汞，是强杀菌剂和消毒剂。0.1%的 HgCl 2 溶液对大多数细菌有杀菌作用，用于非金属器皿的消毒。红汞（汞溴红）配成的红药水则用作创伤消毒剂。汞盐对金属有腐蚀作用，对人和动物亦有剧毒。银盐为较温和的消毒剂。医药上常有用 0.1%1.0%的硝酸银消毒皮肤，用 1%硝酸银滴入新生婴儿眼内，可预防传染性眼炎。铜的化合物如硫酸铜对真菌和藻类的杀伤力较强。常用硫酸铜与石灰配制的溶液来抑制农业真菌、螨以及防治某些植物病害。5 其他其他 消毒与杀菌剂消毒与杀菌剂 如无机酸、碱能引起微生物细胞物质的水解或凝固，因而也有很强的

41、杀菌作用。微生物在 1 氢氧化钾或 1 硫酸溶液中 5 10 分钟大部分死亡。毒性物质如二氧化硫、硫化氢、一氧化碳和氰化物等可与细胞原生质中的一些活性基团或辅酶成分特异性结合，使代谢作用中断，从而杀死细胞 染料特别是碱性染料，在低浓度下可抑制细菌生长。结晶紫、碱性复红、亚甲蓝、孔雀绿等都可用作消毒剂，1：100 000 的结晶紫能抑制枯草杆菌、金黄色葡萄球菌以及其他革兰氏阳性细菌的生长。但其浓度需达 1：5000 时才能抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌生长。磺胺与叶酸合成前体对氨基苯甲酸（磺胺与叶酸合成前体对氨基苯甲酸（PABA）的结构）的结构类似。叶酸是辅酶，在氨基酸、维生素、核酸和蛋白类似。叶酸

42、是辅酶，在氨基酸、维生素、核酸和蛋白质合成中起重要作用，很多细菌需要自己合成叶酸才质合成中起重要作用，很多细菌需要自己合成叶酸才能生长。能生长。为什么磺胺对人体细胞无毒性？为什么磺胺对人体细胞无毒性？因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，故不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酶，故不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸，而必须直接利用营养物中的叶酸做为生长因子。酸，而必须直接利用营养物中的叶酸做为生长因子。青霉素抑制藤黄微球菌的生长青霉素抑制藤黄微球菌的生长

43、 药物受体的亲和性或数量下降药物受体的亲和性或数量下降,如大肠杆菌耐药菌株的如大肠杆菌耐药菌株的30S核核糖体亚基发生改变糖体亚基发生改变,不再与链霉素结合不再与链霉素结合,从而使链霉素失活；从而使链霉素失活；被药物阻断的代谢途径发生遗传改变，如有的抗磺酸药物的被药物阻断的代谢途径发生遗传改变，如有的抗磺酸药物的菌株菌株,改变了二氢叶酸合成酶的性质改变了二氢叶酸合成酶的性质,合成了一种对磺酸药物不合成了一种对磺酸药物不敏感的酶。敏感的酶。补：微生物纯培养的分离补：微生物纯培养的分离 研究微生物生长通常采用微生物纯培养。研究微生物生长通常采用微生物纯培养。微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖

44、得到的微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。后代称为纯培养。自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微自然环境如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也常生物混杂在一起的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也常含有多种细菌及其它微生物。含有多种细菌及其它微生物。一、无菌技术一、无菌技术 无菌技术：是将微生物分离、转接及培养时无菌技术：是将微生物分离、转接及培养时防止被其它微生物污染的技术。防止被其它微生物污染的技术。1、对使用的器皿及用具的灭菌、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和

45、高温干通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微生物热灭菌，效果达到无菌（不含任何微生物)。3 3、无菌的环境、无菌的环境 （1 1）在操作过程中的无菌要求：接种、分离过）在操作过程中的无菌要求：接种、分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操作）。程的无菌效果（在火焰上部进行操作）。（2 2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中进行操）在超净工作台、无菌室和无菌箱中进行操作。使用甲醛、紫外线、作。使用甲醛、紫外线、75%75%的乙醇等进行预处的乙醇等进行预处理及其他的必要措施。理及其他的必要措施。（3 3）如进行好氧培养需对空气进行处理，实验）如进行好氧培养需对空气进行处理，实

46、验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空气，工业中室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空气，工业中使用空气过滤器过滤空气。使用空气过滤器过滤空气。微生物纯培养的分离方法一微生物纯培养的分离方法一稀释涂布法分离微生稀释涂布法分离微生物物 将经过稀释的样品滴加入已制好并灭好将经过稀释的样品滴加入已制好并灭好菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将菌液均匀菌液均匀 的涂抹在整个平板上，经培养的涂抹在整个平板上，经培养长出单一菌落。具体分为两种方法：将长出单一菌落。具体分为两种方法：将0.1ml0.1ml样品加入固体培养基表面，用无菌样品加入固体培养基表面，用无菌涂布棒均匀涂抹进行培养

47、（适用于某些涂布棒均匀涂抹进行培养（适用于某些严格好氧菌）或者将样品加入到无菌的严格好氧菌）或者将样品加入到无菌的培养皿中，加入培养皿中，加入4550 4550 固体培养基迅固体培养基迅速混匀进行培养。速混匀进行培养。微生物纯培养的分离方法二微生物纯培养的分离方法二稀释倒平板法分离微生物稀释倒平板法分离微生物（2 2）稀释倒平板法）稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释，取一定首先将待分离的样品进行连续稀释，取一定稀释度的样品涂布平板或者取一定稀释度的样稀释度的样品涂布平板或者取一定稀释度的样品和熔化的营养琼脂混合（对于热敏感菌不适品和熔化的营养琼脂混合（对于热敏感菌不适用），培养到平板

48、上长出单一的菌落。对于涂用），培养到平板上长出单一的菌落。对于涂布平板的样品菌落通常仅长在平板的表面，对布平板的样品菌落通常仅长在平板的表面，对于与营养琼脂混合的样品菌落通常出现在平板于与营养琼脂混合的样品菌落通常出现在平板的表面和内部。的表面和内部。微生物纯培养的分离方法三微生物纯培养的分离方法三平板划线法分离微生物平板划线法分离微生物 将灭好菌的琼脂培养基倒入培养皿中，凝将灭好菌的琼脂培养基倒入培养皿中，凝固后用接种针取少量的需分离菌，在培养基固后用接种针取少量的需分离菌，在培养基的表面上进行划线，经培养后形成菌落。菌的表面上进行划线，经培养后形成菌落。菌落在划线开始处较密集，在划线的结束

49、处少，落在划线开始处较密集，在划线的结束处少，当有单个孤立的菌落时，就达到分离的目的。当有单个孤立的菌落时，就达到分离的目的。划线的方法有：连续划线法、扇形划线法、划线的方法有：连续划线法、扇形划线法、方格划线法和平行划线法。方格划线法和平行划线法。特点：快速、方特点：快速、方便。便。分区划线适用于分区划线适用于浓度较大的样品；浓度较大的样品；连续划线适用于连续划线适用于浓度较小的样品；浓度较小的样品；4 4、选择性培养分离法、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。行分离。利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离富集培养富集培养