药物制剂的微生物检验PPT参考幻灯片

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1、第一节第一节 体外抗菌试验体外抗菌试验 药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的菌或杀菌药物的抑菌试验抑菌试验；测定药物杀菌活性；测定药物杀菌活性的的杀菌试验杀菌试验；以及检查两种药物联合作用的；以及检查两种药物联合作用的联联合抗菌试验合抗菌试验等。一般抑菌药物只能抑制微生物等。一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。

2、第十七章第十七章 药物制剂的微生物检验药物制剂的微生物检验 药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。在我们检测时，药物的作件下相对而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、用受到用药时培养基的组成、温度、PHPH值及值及所用的菌种、菌量等各个因素有关。所用的菌种、菌量等各个因素有关。虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是由于体外抗菌试验没有复杂的体内因素影响，由于体外抗菌试验没有复杂的体内因素影响，因此药物体外抗菌试验和体内抗菌试验可能因此药物体外抗菌试验和体内抗菌试验可能会出现不一致的结果。所以，一

3、般我们在体会出现不一致的结果。所以，一般我们在体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。话，才能推荐应用到临床。一、药物的体外抑菌试验一、药物的体外抑菌试验（一）体外抑菌试验（一）体外抑菌试验 药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。1 1、连续稀释法、连续稀释法 稀释法有稀释法有液体培养基连续稀释法和固体液体培养基连续稀释法和固体稀释法稀释

4、法（斜面法）两种。这两种方法都可以（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（用来测定药物的最小抑菌浓度（MICMIC）：是）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用用gmlgml或或U/mlU/ml表示。表示。（1）液体培养基连续稀释法）液体培养基连续稀释法(2)固定培养基连续稀释法固定培养基连续稀释法1)平板法平板法 将系列浓度的药物混入琼脂平板，将系列浓度的药物混入琼脂平板，用微量加样器或多点接种仪接种试验菌，用微量加样器或多点接种仪接种试验菌，可在一组平板上测定多种试验菌的可在一组平板上测定多种试验菌的MIC。2)斜面法斜面法

5、将不同浓度的药物混入培养基中将不同浓度的药物混入培养基中制成斜面，然后在斜面接种一定量试验菌，制成斜面，然后在斜面接种一定量试验菌，培养后观察其培养后观察其MIC值。值。2.2.琼脂扩散法琼脂扩散法 利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。用于细菌和酵母菌的药敏试验。1 1）滤纸片法（纸碟法）滤纸片法（纸碟法）滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试试验（初步药物是否有抗菌

6、作用）及临床的药敏试验。验。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。纸片实用一些而且准确一些。世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如：件下根据抑菌圈大小来判断，比如：抗生素或化疗药物抗生素或化疗药物 抑菌圈直径（抑菌圈直径（mmmm）耐药耐药 中敏中敏

7、敏感敏感氯霉素氯霉素 12 13-17 1812 13-17 18红霉素红霉素 13 14-17 1813 14-17 18四环素四环素 14 15-18 1914 15-18 19卡那霉素卡那霉素 13 14-17 1813 14-17 18(2)挖沟法挖沟法(3)打孔法打孔法（二）体外杀菌试验（二）体外杀菌试验 杀菌试验是用来评价药物对微生物的致杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。死活性的。1 1、最低杀菌浓度（、最低杀菌浓度（MBCMBC）（最小致死浓）（最小致死浓度度MLCMLC）的测定）的测定 按液体培养基稀释法的操作方法测定药按液体培养基稀释法的操作方法测定药物的物的MIC

8、MIC。然后把未长出菌的各个试管培养液。然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是最小致死浓度无菌生长的药物最低浓度就是最小致死浓度（MLCMLC）。如果是细菌的话可以称为最小杀菌）。如果是细菌的话可以称为最小杀菌浓度（浓度（MBCMBC）。）。2 2、活菌计数法活菌计数法 将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作用一定时间后，取样进行活菌数计数，物中，作用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生物数量计算出药物对试验菌的致从存活的微生物数量计算出药物对试验菌的

9、致死率，从而判断药物的杀菌能力。死率，从而判断药物的杀菌能力。活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。3 3、酚系数测定（石炭酸系数测定）、酚系数测定（石炭酸系数测定）酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂

10、与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。由于各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因由于各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因而这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测而这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。定。具体的测定方法是分别将酚及待测化学消毒具体的测定方法是分别将酚及待测化学消毒剂按不同比例稀释，各取剂按不同比例稀释，各取5ml5ml放到试管中，再加放到试管中，再加入经入经2424小时培养后的菌悬液各小时培养后的菌悬液各0.5ml0.5ml，混匀后放，混匀后放入入 2020水浴中，水浴中，5 5、1010、1515分钟分别取一接种环分钟分别取

11、一接种环混合液移种到另一支混合液移种到另一支5 ml5 ml的肉汤培养基中，的肉汤培养基中，3737培养培养2424小时记录生长情况。小时记录生长情况。（三）联合抗菌试验（三）联合抗菌试验 联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。两种抗菌药联合物联合应用时的相互影响。两种抗菌药联合应用时抗菌作用加强的称为协同作用；抗菌应用时抗菌作用加强的称为协同作用；抗菌作用减弱的称为拮抗作用；相互无影响的称作用减弱的称为拮抗作用；相互无影响的称为无关。常用的联合抗菌试验的方法有以下为无关。常用的联合抗菌试验的方法有以下几种。几种。棋盘棋盘法的设计 棋盘棋盘

12、法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。在进行棋盘棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的MIC，然后以两药MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8浓度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4浓度）分别进行联合。可见举例，如表1的青霉素G与链霉素联合药敏实验。药物及浓度 青霉素G(IUm1)链霉素单药对照 4 2 1 0.5 0.25链霉素（gml）64 -32 -16 -8 -+4 -+青霉素G单药对照 -+细菌对照-：无细菌生长 +：有细菌生长FIC指数=11+16

13、16=2无关 2.2.纸条试验纸条试验在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作用。用。二、二、药物的体内抗菌试验药物的体内抗菌试验 药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质要受体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质

14、或磷脂、脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活或磷脂、脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物，代谢活动较低，对药物的敏感性降低，体内的微生物，代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌度难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。试验外还需

15、要做体内的抗菌试验。三、影响抗菌试验的因素三、影响抗菌试验的因素 1 1、试验菌种、试验菌种在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国家在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国家卫生部生物制品检定所菌种保藏中心专门提供卫生部生物制品检定所菌种保藏中心专门提供的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临床的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是对数期而且我们要用到的试验菌种应该选择是对数期生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对于我试验测定的结果也会准确些。于

16、我试验测定的结果也会准确些。2 2、培养基培养基 试验所有到的培养基应按各试验菌的营养试验所有到的培养基应按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程。要注意当有些药物具量及培养基的配制过程。要注意当有些药物具有抗代谢作用时，培养基应不能存在代谢物，有抗代谢作用时，培养基应不能存在代谢物，否则抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有否则抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有血清等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，血清等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，使抗菌药物失去，所以就要避免培养基混进这使抗菌药物失去，所以就要避免培养基

17、混进这类营养物。类营养物。3 3、供试药物供试药物 药物的物理状态、浓度、稀释方法等都药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使药物溶解或使药物如果是固体药物，必需使药物溶解或使药物呈均匀悬液。呈均匀悬液。PHPH值应调至中性，以确保药物值应调至中性，以确保药物的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有鞣质，结果的判断，应特别注有颜色和含有鞣质，结果的判断，应特别注意。意。四、对照试验四、对照试验 为确保试验结果的科学性和准确性，为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。试验时应同时进行各种对照试验。试验菌对照：在无药情况下，应能在试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。培养基内正常生长。溶剂及稀释液对照：配制抗菌药物时溶剂及稀释液对照：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。已知药物对照：应使已知抗菌药物对已知药物对照：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应。标准菌株出现抗菌效应。