科研立项项目申报书β胡萝卜素提取

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1、编 号XXXX大学生科研项目申报书项目名称： -胡萝卜素的提取 申 请 者： XXX 申报时间： 2009年8月10日 项目类别： A类( ) B类（ ）共青团苏州科技学院委员会申请简况表说明：1、必须由申报者本人按要求填写。2、院（系）推荐意见签章视为对申报者情况的确认。项目名称-胡萝卜素的提取所属科类理科申请人姓 名xxx性 别女出生年月1989年07月院（系）化学与生物工程学院专 业生物技术年 级二年级联系电话合作者姓 名性 别年 龄学 历所在单位备注本科在读苏州科技大学有无合作者（ ）无院系认证是否为我校正式注册在校的学生（专科生、本科生）。( )是 ( )否本课题是否为学生课外学术科

2、技作品。( )是 ( )否其它：签 章：年 月 日项目主要内容目前，全球-胡萝卜素的生产量约为600t/a，年需求量为12001500 t，且每年以7%9%的速度增长。美国的需求量近些年以10%15%的速度递增。且在欧美和日本等国已形成市场。2000年中国-胡萝卜素的生产量为10 t，其中40%用于出口。2001年我国-胡萝卜素的生产能力为22 t，国内-胡萝卜素的总消费量的的70%用于食品工业，其次用于保健品和医药行业1。因-胡萝卜素可用作食品添加剂，饲料添加剂和化妆品助剂，且-胡萝卜素在防治癌症和心血管疾病方面有特殊的作用，所以，-胡萝卜素越来越引起人们的关注和兴趣。目前，市场上有多种-胡

3、萝卜素的生产方法：化学合成法：化学合成法是指采用有机化工原料，通过化学合成反应，人工合成-胡萝卜素的一种方法。提取法：即从胡萝卜、枸杞、马铃薯、玉米等天然植物原料中直接提取-胡萝卜素的一种方法。生物合成法：生物合成法是指利用微生物培养技术，通过微生物的培养，利用微生物在其体内合成-胡萝卜素，然后自微生物体内分离得到-胡萝卜素的一种方法。利用三孢布拉氏霉菌生产-胡萝卜素就是生物合成法的一种。研究表明，采用三孢布拉氏霉菌发酵生产胡萝卜素不仅因其胡萝卜素合成水平极大高于多种生物体，而且-胡萝卜素含量在85%以上，其结构与标准的-胡萝卜素相同；而且具有生产原料易获得，不受自然条件限制，周期短和适用于工

4、业化生产等优点。可以确认三孢布拉氏霉菌是目前应用于工业生产胡萝卜素最重要的菌株。下面就目前状况对其理化性状，生理功能以及利用三孢布拉氏霉菌生产-胡萝卜素的方法做一介绍。1 -胡萝卜素的理化性状-胡萝卜素，分子式为C40H56，分子量为536.88。深红紫至暗红色有光泽的斜面6面体或板状微结晶的晶体或结晶性粉末。有轻微异臭或异味。稀溶液呈橙黄色至黄色，浓度增大时带橙色因溶液的极性可稍带红色。遇氧、热、光不稳定，在弱碱下较稳定。不溶于水、丙二醇、甘油、酸和碱；溶于二硫化碳、项目主要内容2 苯、氯仿、己烷及植物油；几乎不溶于甲醇和乙醇。在人体和动物的肠黏膜及肝脏中，1分子的-胡萝卜素在15=15碳原

5、子位置，通过加氧酶的催化作用下，分裂为2分子的视黄醛，经过还原过程，形成2分子的视黄醛，经过还原过程，形成2分子的视黄醇（VA）。3 -胡萝卜素的生物提取技术3.1 材料与方法3.1.1 菌种与培养基3.1.1.1菌种：三孢布拉氏霉菌JM9203（正株）、JM9204（负株）。3.1.1.2培养基：PDA.斜面培养基：15%新鲜去皮马铃薯；2%葡萄糖；2%琼脂，PH自然。分装试管后，0.1Mpa灭菌20min，斜面表面水干后使用。液体种子培养基：淀粉4%；葡萄糖2%；玉米浆5%；KH2PO40.1%；MgSO40.01%；VB11mg/100ml；消前PH6.7，装量为40ml/250ml三角

6、瓶，0.1Mpa灭菌20分钟。摇瓶发酵培养基：淀粉4%；黄豆饼粉4%；玉米浆3%；KH2PO40.1%；MgSO40.01%；盐酸硫胺素10mg/L；灭菌前调PH7.7，装量为50ml/500ml三角瓶，0.1Mpa灭菌40分钟。补料：在发酵48h左右添加0.1%-紫罗兰酮及适量无菌水。3.1.2方法3.1.2.1碳、氮源实验：在种子培养基或摇瓶发酵培养基中改变碳、氮用量比。装量为40ml/250ml三角瓶，每组设三个重复，0.1Mpa灭菌40分钟。“+、-”菌株按5：5的比例总量10%接种，于28C、200rpm振荡培养。培养48h，无菌操作补加0.1%-紫罗兰酮。培养至120h终止。3.1

7、.2.2培养基正交实验：在单因素试验后，确定了培养基中的四种因素及三个水平按L9排列组合。装量为50ml/500ml三角瓶，三个重复。3.1.2.3-胡萝卜素的测定方法：离心收集发酵液中的菌丝体，5055C真空干燥、研磨。有机溶剂提取菌体中的色素14。采用紫外分光光度计测定最高吸收峰的吸光值，参照方法15测定并计算-胡萝卜素的含量。3.1.2.4菌种试验：除种子培养基碳源试验外，菌种不同性别发酵试验以及种龄试验均按常规方法进行。3.1.2.5生物量测定：准确量取发酵液，用双层纱布过滤，自来水反复冲洗、拧干、撕成碎片置于平面皿内，5055C抽真空干燥，用1/100g精确度天平称量。试验结果表明，

8、以4%为碳源较为适宜，生物量和-胡萝卜素的生产水平都较高。虽然在4%淀粉的基础上再添加1%葡萄糖总色素水平有所提高，但是-胡萝卜素未增加，因而无实际意义。而且用葡萄糖为种子培养基的碳源培养基质粘性差，不利于菌丝体伸张，易形成较大的团块，这样可能造成种子菌体被接入发酵培养基后营养物质的利用不充分。3.2.1.2培养基中的氮源对-胡萝卜素的影响由于试验所采用的氮源均为农、副产品，其营养成分与含量差异较大，因而不同的氮源物质对-胡萝卜素合成水平有很大的影响。以棉籽仁和黄豆饼粉为主要氮源所组成培养基较为适宜，而玉米浆与棉籽仁或黄豆饼粉混合使用更有利于提高生物量和-胡萝卜素的生产水平。3.2.1.3培养

9、基正交试验在碳、氮物质因素试验后，拟定淀粉、黄豆饼粉、玉米浆以及植物油为影响三孢布拉氏霉菌合成-胡萝卜素水平的主要因素设计正交实验。实验表明，培养基组合3无论其生物量还是胡萝卜素水平均高于其它组合，因其碳、氮以及植物油配较佳所致。影响胡萝卜素合成水平的主要因素依次为植物油、淀粉，影响影响较小的应为黄豆饼粉。3.2.2菌种试验结果3.2.2.1菌株的性别：三孢布拉氏霉菌有雄性（+）和雌性（-）菌株，在相同条件下，单独发酵“+”和“-”株，其类胡萝卜素合成水平分别为36.6mg和263.7mg/L发酵液，而当“+” “-”菌株混合发酵时，其胡萝卜素合成水平达1113mg/L发酵液，这是因“+”和“

10、-”株混合培养有利于产生促进胡萝卜素的三孢酸所起的作用。3.2.2.2菌种培养时间：分别采用培养24、32、40、44和48h的液体菌种发酵试验结果表明，培养3248h的菌种均可用项目主要内容于发酵，但培养4044h的菌种更有利于胡萝卜素的合成。在实验室条件下，通过对三孢布拉氏霉菌合成-胡萝卜素、菌种培养基摇瓶发酵比较实验，以生物量（每升发酵液中菌丝体干重）、类胡萝卜素和-胡萝卜素合成水平为结果标准，筛选出适用于发酵三孢布拉氏霉菌培养基的碳、氮源物质和配比。同时对植物油的选择与用量、中间添加-紫罗兰酮也进行了实验，证明这些物质均不同程度的影响着三孢布拉氏霉菌合成-胡萝卜素水平，为深入研究三孢布

11、拉氏霉菌的发酵与-胡萝卜素产品研制奠定了基础16。经湖北省卫生防疫站食品卫生检测所检测，急性毒性试验所得结果送检样品属实无毒级；小鼠精子畸变试验，实验组与阴性对照结果无显著差异，表明该受试物的精子畸变实验为阴性；小鼠骨髓嗜多染色红细胞微核试验，实验组与对照组的结果无显著差异，表明该受试物的微核实验为阴性。因此证明，利用三孢布拉氏霉菌发酵生产出来的-胡萝卜素无污染、无毒害，可用于大规模的工业生产17。结束语-胡萝卜素易于氧化，所以不管采用何种设备方法，都必须防止生产过程中-胡萝卜素不必要的损失。针对目前-胡萝卜素供不应求的状况，探索出一种成本低、产率高、无污染、无毒害、适于大规模工业生产的制备-

12、胡萝卜素的方法非常必要。-胡萝卜素在医药、食品、及保健领域有着很好的应用市场，特别是近年来，随着癌症发病率的升高，-胡萝卜素因其有着特异的功效，所以近年来一直是市场上供不应求的紧俏商品。所以深入对其的认识，大力开发-胡萝卜素的产业，将推动食品、医药、饲料、化妆品行业的发展，具有很好的市场前景。项目的价值和意义项目的价值和意义项目的价值和意义项目的价值和意义-胡萝卜素是维生素A的重要来源由上述的-胡萝卜素的理化性状可知，1分子的-胡萝卜素在体内酶的作用下可转变为2分子的维生素A，且在食物中含量最丰富，因而被认定是人体内维生素A的主要来源。通过实验发现2，缺乏维生素A的大鼠补饲-胡萝卜素后能显著提

13、高体内维生素A的水平，从而证实了-胡萝卜素能在体内酶的作用下转化为维生素A，发挥维生素A的作用，所以又称维生素A源原。该转化酶在体内维A缺乏时将-胡萝卜素转化为维A，当体内维A增加到需求量时，酶即停止转化，从而通过酶的自动控制来维持体内维A的的需要。全世界，特别是发展中国家人体所需的维A60%70%来源于-胡萝卜素。维A是合成糖蛋白的载体，糖蛋白是细胞的重要结构物质，尤其是上皮细胞，如果缺少糖蛋白将对眼，呼吸道，皮肤，消化道，泌尿道及生殖器官产生影响。免疫球蛋白也是一种糖蛋白，维A缺乏将会影响抗体的形成。因此，维A对保证正常的生长和发育及抗感染具有重要的作用。但是，人体摄入大量的维A，会引起急

14、性及慢性中毒主要是骨痛，皮肤黏膜改变，颅内压升高等。而-胡萝卜素本身无毒性，当摄入大量的-胡萝卜素时体内产生积蓄，但不会引起中毒3。因此，无论是治疗维A缺乏症还是防止癌症，使用-胡萝卜素都更好，更安全。2.2-胡萝卜素是具有抗氧化作用人体在正常的生理代谢过程中会产生少量的含氧自由基，而体内的防御机制（抗氧化酶或抗氧化剂）会及时将其清除，以维持氧自由基的代谢平衡。因此一般不会对细胞，组织产生损伤。但随着年龄的增长或在某些病理状态下，体内抗氧化酶的作用下降，过多的氧自由基不能被及时清除而堆积在细胞内，导致它们迅速与机体内的一些生物大分子，如蛋白质、核酸氨基酸、脂类等发生反应，生成氧化物或过氧化物。

15、这些物质会对细胞产生毒性，使细胞膜、组织、酶以及基因受损，从而引起机体多种疾病的发生和衰老。-胡萝卜素的抗氧化作用是基于它分子中的多个共轭多烯双键的特殊结构，这种结构使它能与含氧自由基发生不可逆反应，生成非常稳定的以碳为中心的自由基-car，这个碳核自由基可以迅速可逆的与氧反应生成一种新的带链的过氧化自由基-car-OO。但这个可逆反应的速率受氧分压的影响非常大，当氧分压降低时，反应就会充分的向碳核自由基的方向进行，这样就有效的降低了体内过氧化自由基的浓度，并能及时阻止自由基的链式反应，因此也减少了体内脂质过氧化的数量。由此可知-胡萝卜素是一种有效的抗氧化剂，类萝卜素也因可以清除自由基以及淬灭

16、单线态氧的活性受到了普遍关注。日益增加的研究表明与衰老的过程相关联的多种缺陷是细胞内的多点位氧化损伤积累的直接后果2。例如：心血管疾病的发病机理之一是低密度脂蛋白的氧化损伤而导致的；一些光化学对晶体所造成的损伤的会导致白内障的形成等。而-胡萝卜素的高效抗氧化性能使活性氧变为稳定的氧分子。荷兰的一项研究表明，具有摄取含-胡萝卜素这种健康饮食习惯的老人，发生心力衰竭的危险性较低。现已知1分子-胡萝卜素可抑制1000个分子的活性氧4，同时还可以作为一种弱氧化剂直接与自由基反应，阻止自由基的连锁反应，从而减少它对细胞的损伤。在探讨抗氧化营养对DNA氧化损伤保护作用时，经研究发现连续服用-胡萝卜素、维生

17、素E和维生素C，可显著降低由过氧化氢诱发DNA的损伤5。2.3-胡萝卜素可以促进细胞缝隙间连接交流-胡萝卜素细胞间形成的间隙连接使细胞质相互沟通，通过交换小分子来调节代谢反应。间隙连接的基本单位是连接子，每个连接子由2个相同或相似的跨膜蛋白压单位环绕，中心形成一个直径约1.5nm的孔道，相邻细胞质膜上的两个连接子相对便形成一个间隙单位。它允许小的代谢物、细胞内信息及离子自由出入，但蛋白质、mRNA等大分子则被排除在外，以保持各细胞的遗传一致性。Bertram等发现-胡萝卜素和其它类胡萝卜素可以加强细胞间隙连接的交流能力，从而抑制或降低癌症的发生或发展；Yamasaki也指出构成细胞连接通道的连

18、接蛋白，在转化阶段的癌细胞会由于通道的受阻而干扰细胞的交换，这种交换是控制生长的因素之一，从而抑制癌症诱导细胞升级到恶化阶段6。国内外进行了大量的关于-胡萝卜素的抗肿瘤机制的研究，认为-胡萝卜素抗癌机理有以下几种：转化为视黄醇（VA）而起作用、抗氧化机制，提高机体免疫力等7.8。多种研究2亦证实-胡萝卜素是细胞间通讯的诱导剂，它能增强转化癌起始细胞与健康细胞的交流作用，而且目前研究人员通过荧光燃料示踪技术已获得-胡萝卜素增强转化细胞和末转化细胞间的GJIC功能的直接证据，但对于其具体的调节机理尚不清楚。2.4-胡萝卜素的可以增强免疫力，提高人体免疫系统抵抗致癌物的能力免疫系统的两个主要功能是抵

19、御细菌或病毒的侵染和防止癌症的发生。类胡萝卜素在增强人体的免疫能力方面具有明显的作用。类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力，B细胞能在体内循环，从而消灭外源入侵的病原体；类胡萝卜素能提高淋巴辅助T细胞（CD4）的活力，能协助B细胞产生抗体，并能提高其它免疫组分的活性；类胡萝卜素能增加嗜中性白血球的数目，它可以包围细菌，并分泌包围细菌的酶；类胡萝卜素能增加自然杀伤细胞（NK）的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。目前，已经有很多关于服用类胡萝卜素对免疫活性的影响的报道。流行病学的研究结果表明9，高剂量的-胡萝卜素的摄入与肺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌的发生率间存在着明显的负相关；与肠癌的发生

20、率存在着中度的负相关；而与乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌的发生率间的相关性不明显或存在着正相关。吃富含-胡萝卜素的食物可增强生物机体的特异性及非特异性免疫功能。目前，称-胡萝卜素为肿瘤的化学防预剂，它消除氧自由基、控制自由基的生成、促进巨噬细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素（IFN）、促进免疫细胞的增殖，增强免疫细胞的免疫功能。世界卫生组织癌症研究中心与我国肿瘤研究所合作，在河南省林县肿瘤高发病区引导居民膳食中添加-胡萝卜素等多种营养素，居民血浆中的抗氧化剂水平明显增高，经过6年的随访结果，林县居民的总死亡率下降13%3。2.5-胡萝卜素其它功能最近临床研究表明，-胡萝卜素的的抗氧化

21、作用可减少紫外光对皮肤的损害，口服-胡萝卜素可防止光敏感性红斑者的形成，并可降低皮肤对紫外光的敏感性，对白班症、白化症也有一定的预防作用10；适量的-胡萝卜素补充可使高密度脂蛋白（HDL）的含量显著增加，从而对心血管疾病发生具有保护作用11；冠心病、心肌梗死、心肌炎等的病发过程与心肌缺血缺氧再灌注有关，-胡萝卜素对心肌细胞缺氧具有保护作用，因此可以对此类疾病起到预防作用12；-胡萝卜素高效能的抗氧化性使它能阻止某些金属所致的细胞毒性13；可以利用-胡萝卜素的抗氧化作用预防老年白内障的发生和发展，血清中-胡萝卜素水平低者其白内障的发病率比高-胡萝卜素者高出2.67倍9；由于-胡萝卜素对机体脂质的抗氧化作用，可用其制剂辅助治疗慢性迁移性肝炎及HIV感染者2。项目经费预算资料费 400 实验材料费 1000试验测试费 1000调研费 400版面费 200总计 3000指导教师意见表说明：由指导教师本人填写指导教师情况姓名性别年龄职称工作单位单位电话对项目的意义、技术水平的评价签 名：年 月 日资格和形式审查及专家委员会意见专家委员会意见签名：年 月 日学校意见签 名：年 月 日