胶体金的制备方法

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1、、制备胶体金的准备（一）玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内 不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色 或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流 水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g，加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸 泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗34次，自来水冲洗掉洗洁剂， 用蒸馏水洗34次，再用双蒸水把每个器皿洗34次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处 理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经

2、制备的胶体金溶液，用同等大 不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这 样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。（二）试剂的配制要求按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体 金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒 直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。 放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍

3、保持稳定。（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸 水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全 溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。柠檬酸三钠还原法(Frens 1973 )此方法是由Frens在1973年创立的，制备程 序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4 溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后 浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸710min出现透明的橙红色。各种颗粒的 胶体金制备详见表5-2。表5-2柠檬酸三钠用量与胶体

4、金颗粒直径的关系0.01%的 HAuCl4（ml）1%柠檬酸三钠(ml)直径(ml)1005.010.01004.015.01001.525.01001.050.01000.7560.01000.6070.01000.4298.01000.32147.01000.25160溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧 化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金 溶液。二、制备胶体金的方法和步骤窄长型膜，依灵敏度及流速的要求,选用孔径不同的合适的膜.自下端至上端(由左至右)由:1. 样品垫(sample pad)2. 载有

5、固相标记配体(抗体或抗原)的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条(conjugate release membrane)3. 合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线，和阴性对照 组线)(ni-trocellulose memtrane)4. 吸水垫(absorbent pad)等四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上 (back sheet)胶体金快速斑点结合免疫分析随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业(diagnostic industry)，免疫分析向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维 膜为载体的快速免疫分析。前者需

6、要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂 盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远 离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”(real time clinical decision) 和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和 广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点 免疫结合分析(dot immunobinding assay, DIBA)，始于80年代。现介绍如下：1两种模式1.1班点免疫渗滤分析(dot immunofiltrtion assay, DI

7、FA)免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行的(flow through type)。1.2 斑点免疫层析分析(dot immunochro-matography assay ,DICA) 分析原理与 DIFA 相同，只是反应液体的流动不是直向的穿透流动，而是层析作用的横向流动lateral flow type)，在1990年开始应用。两种类型快速免疫分析比较见表。表 免疫渗滤分析和免疫层析分析的比较免疫渗滤分析(穿透滤过型)免疫层析分析(横向流动型)硝酸纤维素 膜的种类及 形式组成方 式为圆片膜孔径 较简单，由载有配体(抗体或抗 原)的硝酸纤维素膜片及底层 的吸水垫料组成为窄长

8、型膜，依灵敏度及流速的要求，选 用孔径不同的合适的膜.自下端至上端 (由左至右)由：1. 样品垫(sample pad)2. 载有固相标记配体(抗体或抗原)的玻 璃纤维素膜条或聚酯膜条(conjugate release membrane)3. 合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有 显示阳性结果的捕捉分析物的配体 线,和阴性对照组线)(ni-trocellulose memtrane)4. 吸水垫(absorbent pad)等四部分衔 接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上（back sheet）标记配体的 形式为液相形式根据需要及可能可设计同时大多数为固相形式多功能性测定一种以上分析物加样

9、、洗 涤、加标记同左操作步骤配体及洗涤等步骤大多数只有加样一个步骤注：以上标记配体均为胶体金或硒标记、分散型染料标记等。如为酶标记则二者都必须 增加“加显色底物”的步骤2标记物的种类标记物包括、胶体金属（胶体金，胶体硒）、分散型染料（disperse dyes）和染料标 记的微球（latex particles）等，标记物各有优缺点，可根据以下的标准选择，如：灵敏 度，所需要的颜色，分析的模式和操作步骤，制备、保证重复性、急定性及规模及的难易程 度和重复性，以及标记物所需配体量等。其中酶虽然有高灵敏度，重复性好及标记物易规模 化等优点，但它需要洗涤，加底物等步骤，需要反应的时间也长些，对技术也

10、有一些要求， 故未能作为快速诊断的主要标记物（1985年最初的免疫渗滤分析是以酶作为标记物）。目 前应用最广泛的标记物为胶体金，包括：胶体金免疫渗滤分析（gold immumofiltraition assay GIFA）或滴金免疫分析和胶体金免疫层析分析（gold immunochromatography assay , GICA）。由于GICA更简便快速，已成为目前最主要的快速免疫分析方法之一。3原理胶体金免疫渗滤分析（GIFA）原理与操作步骤基本与ELISA相同：加样品于固定有配体 （抗体或抗原，此处以抗体为例，下同）的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体抗 原复合物，洗涤渗滤后，再加

11、液体的胶体金标记抗体。当结果为阳性时，在膜上固定有抗体 -抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。胶体金免疫层析分析CICA原理与GIFA相同， 只是操作步骤有所不同，如反应液体流动方向由垂直渗滤改为横向层析流动（见表）：样品 加样品垫（1）上，样品向吸水垫（4）方向流动，途径载有固相胶体金标记抗体膜（2）后， 将金标记物完全复溶，抗原与金标记抗体形成金标记抗体-抗原复合物，继续向前流动至硝 酸纤维素膜条（3）上，固定有捕捉抗原的抗体线处。当结果为阳性时，金标记抗体抗原复 合物上，就会形成金标记抗体-抗原-固相抗体复合物，呈现红色阳性条带；如样品中无抗原， 则不被捕获，就不显色，则结果为阴性

12、。多余的游离金标记抗体继续前移至固定有抗金标记 体二抗处，被固定呈现红色的阴性对照。GICA与GIFA不同之处在于后者只是单一的免疫层 析条，不需要其它试剂，一步操作。二者与ELISA不同处是反应时间大大缩短，仅需要数分 钟就完成了 ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固 定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触， 很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用 （immunoconcentraiton）。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附 在固相表面的抗体结

13、合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗 体复合物，故需时间较长。4胶体金块快速免疫结合分析的应用应用领域很广，可分为临床应用与非临床应用两类。目前应用多以前者为主。4.1临床应用 已应用于临床的很多领域。由于目前它还是定性分析，故主要用以检测 正常体认中不存在的生物活性物质（如传染病的抗原及抗体），以及正常情况下体液中含量 很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。随着技术的进展，对某些可确定诊断的、有正常 上限值（cutoff）的生物活性物质也可进行检测。下面列出国内外已应用的项目。传染病（1）各种病毒的相应抗原及抗体：各种病毒性肝炎、巨细胞病毒抗体， 单纯疱疹病毒抗体

14、，风疹病毒抗体，肾综合症出血热抗体，登革热病毒抗体及轮状病毒等;（2）性病：爱滋病病毒抗体，梅青螺旋体抗体，淋球菌及泌尿生殖系统的衣原体等；（3） 细菌：结核杆菌抗体，A族乙型溶血链球菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌抗体等；（4）寄生 虫：疟原虫，血吸虫抗体，包囊虫抗体，弓形虫抗体等。激素目前用于生殖标志物，主要有诊断早早孕的人绒毛膜促性腺激素（HCG） 和检测排卵的促黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）等。心血管病急性心肌梗死的标志物，包括肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌红蛋白， 肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质（PABP）等。还有与心血管疾病有重要关系的D-二聚体 （D-dimer）的检测。肿瘤

15、包括对肿瘤进行筛查和早期诊断有意义的肿瘤标志物，如前列腺特异抗 原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜血免疫 检测（FOB）等。自家免疫病 抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自家免疫病的甲状腺过氧化物酶 （TPO）抗体。毒品检测尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报道有可 同时测7种毒品的GICA。其它检测C-反应蛋白，半定量检测血清a-脂蛋白。4.2非临床应用可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生物战剂的快速检 测，兽医学及法医学等方面检测。5制作及操作中需注意的问题以GICA为例，它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析

16、分析条，许多条件及条件 的组合都会影响到它的质量，包括：（1）硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孔径的适宜性，结合配 体（抗原或抗体）容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速 度的均一性等；（2）捕捉配体的量及质量（配体的纯度，亲和力及滴度）及在膜上配体的包被量和均一 性。配体划线位置的固定一致性；（3）固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标记物的稳定 性，复溶性，复溶速度及流动性，所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等；各种膜，甚至包括样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。以上条件都可以综合影响胶体免疫层析的质量控制，主要包括：灵敏

17、度，阴阳性界限值 （cutoff）的准确性和一致性及层析条间的重复性等。）（1）灵敏度：因测定主要针对正常人体液中不存在或含量很低的生物活性物质的定性结果。高灵敏度及其重复性是最重要的质量控制指标。为此，生产厂家在保证分析条的各种优化条 件外，还应提供能确证灵敏度的标准品，供操作者检验其灵敏度和重复性。另外，还应配有 相应的阳性及阴性对照血清以供对照之用。(2)阴阳性界限值的准确性和重复性：避免发生假阴性人假阳性结果，保证结果的正确。 生产厂家应提供确定界限值的标准品，最好还要提供低于或高于界限值的标准品(注明浓 度)，以供使用者对结果的判断。6应用的重点和展望临床应用的重点应放在：(1)急需

18、快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌 梗死的急性心梗标志物就是很好的例子。有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病(病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病)流行病调查；某些肿瘤(如前列腺癌，结 肠癌，肝癌，乳腺癌)的普查及预防检查；围产期的健康普查等。它可以作为快速的初筛普 查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。今后的发展：(1)全面提高质量。突出质量控制的保证，为进一步发展打好基础。(2) 提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析，应尽量缩小差 距。除使用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体(特别是配伍好的优质单 抗)，优质高比度的

19、标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物素 -链亲和素系统，用链亲和素作为膜上的捕捉配体，分别用生物素化和胶体金标记的配 伍良好的优质的特异性单抗与分析物形成免疫复合物。应用链亲和素与生物素结合的四 价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。此外，链亲和素-生物素系统还可以作为 一种通用的分析系统，检测不同的抗原。由于链亲和素价格较贵，也可用高质量的抗生 物素抗体作为通用的检测系统。(3) 实现半定量和定量化。可通过精确控制膜上捕捉配体的量，使用多条平行捕捉配 体线的方法，通过显色条带的数目，判断分析物的浓度区间，得到半定量的结果；应 用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度，

20、换算成浓度值，实现定量的估算。德 国宝灵曼生产的肌钙蛋白-T及相应的测量仪(strip reader)即可显示出免疫层析条 上肌触目惊心蛋白-T的量。香港研制的FABP胶体金免疫渗滤分析也配有定量分析仪， 可进行定量测定。二者均成为患者床旁诊断急性心肌梗死的快速灵敏方法。(4) 检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物，如乙型肝炎不 同的抗原及抗体。国外已有同时测几种心梗标志物及测定多种毒品的胶体金免疫分析。(5) 建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，以减少分离血清的音间。德 国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者 床旁检查

21、和边远地区的普查都有实际应用意义。免疫胶体金的制备及其在医学检验中的应用周友泉斑竹胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。1971年Faulk和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为 一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检 验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法 (Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HB

22、sAg、HCG 和抗双链。 NA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。免疫胶体金技术的基本原理氯金酸(HAuCl4 )在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负 电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标 记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可 能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结 合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金 颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免 疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等

23、非共 价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有 高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标 记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或 半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之 为免疫金银染色。胶体金的制备方法胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、 白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。1、玻璃容器的清洁：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切 玻

24、璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于 5%二氯二甲硅烷的氧仿溶液中1分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。 专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可 代替硅化处理。2、试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使 用金属药匙，避免接触天平称盘。其1%水溶液在4。可稳定数月不变。实验用 水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH电极测定金溶液的pH值。 为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠 檬酸磷酸盐(pH3

25、 5.8)、Tris-HCL (pH5.8 8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5 10.3) 等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。3、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶：取0.01 %氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠 水溶液0.7ml ,金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分 钟，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在 535nm ,A1cm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一 旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化， 这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫

26、凝集试验的基础。金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条 件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒 径的金溶胶，见附表。附表100 ml氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响1%柠檬酸三钠ml 0.300.450.701.001.502.00金溶胶颜色蓝灰紫灰紫红红橙红橙吸收峰(nm)220240535525522518径粒(nm)14797.571.5412 4.5154、柠檬酸三钠-鞣酸混合还原剂：用此混合还原剂可以得到比较满意的金 溶胶，操作方法如下：取4ml 1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H2O)，加入0 5ml 1

27、%鞣酸，0 5ml 25mmo/L K2CO2 (体积与鞣酸加入量相等)，以双蒸馏 水补至溶液最终体积为20ml，加热至60C取1ml 1%的HAuCl4，加于79ml 双蒸馏水中，水浴加热至60C，然后迅速将上述柠檬酸-鞣酸溶液加入，于此 温度下保持一定时间，待溶液颜色变成深红色(约需0.5 1小时)后，将溶液加 热至沸腾，保持沸腾5分钟即可。改变鞣酸的加入量，制得的胶体颗粒大小不同。5、白磷还原法：在120ml双蒸馏水中加入1.5ml 1%氯金酸和1.4ml0.1mol/L K2CO3，然后加入1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温 放置15分钟，在回流下煮沸直至红褐色转变为红色。

28、此法制得的胶体金直径 约6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级 后制得胶体金颗粒直径的变异系数（CV）可小于15%。免疫胶体金制备1、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶 胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄 清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表 面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。2、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取 0.1ml（

29、含蛋白质540ug）加到1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照 管，5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶 将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。3、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情 况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。下述标记步骤最为常见： 用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH（标记SPA时调到 pH6.0）。 于100ml金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为23ml ）,搅拌 23分钟。 加入5ml 1%PEG20000溶液。 于10

30、000 100000g离心30 60分钟（根据粒径大小选择不同离心条件）， 小心吸去上清液（切忌倾倒）。 将沉淀悬浮于一定体积含0.20.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀 后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜，以0.5mg/ml 叠氮钠防腐，置4C保存。 包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以 含0.1 %BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2 , 以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处 理。胶体金的稳定性及

31、免疫胶体金的贮存胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可 放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解 质等。金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解 质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定 量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的 加入有良好的稳定效果。当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取 决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定， 提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记

32、后的胶体金溶 液可用0.20.5mg/ml PEG20000作为稳定剂。在410。贮存数月有效，不 宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。免疫胶体金的应用1、胶体金在电镜水平的应用胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可 以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为315nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。315nm的胶体金多用于单一抗原颗粒的 检测，而直径15nm多用于检测量较多的感染细胞。胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。单层培养中细胞内抗原的检测。组织抗原的检测。金标记在电镜水平的应用，主

33、要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫 负染色、双标记技术和原位杂交技术等。实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和 特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和 诊断。2、胶体金在光镜水平的应用胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞 涂片、切片均可应用。主要用于：用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养 的单层细胞的膜表面抗原。检测培养的单层细胞胞内抗原，组织中或亚薄切 片中抗原的检测。胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内 部酶活性干扰等缺点。3、胶体金在流式细胞仪中的应用：应用荧光

34、素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学 研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困 难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行 几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角， 因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。4、凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一 原理可定性或定量地应用于免疫反应。5、免疫印迹技术(immunoblottin

35、g):免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用 酶免疫法(或免疫荧光、RIA)进行定量。免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体 保温后，再与经葡萄球菌A蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根 据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒 的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至0.1ng，这种免疫金银染 色法应用已日趋广泛。由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫 诊断上有很大的应用潜力。

36、6、胶体金在肉眼水平的应用胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身 具有的特点外，还有以下优点：试剂和样本用量极小，样本量可低至1 2ul ; 不需Y-计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； 没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；实验结果可以长期保存；时间大大缩短，提高了检测速度。金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓 度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质 活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到ELISA的水平。而结 合银染色时，检测的敏感性更大大提高。胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用免疫层

37、析法（immunochromatography ）是近几年来国外兴起的一种快速诊断 技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的 硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜 向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特 异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现 特异性的免疫诊断。图一、左，正现图 右：纵切图1 ,吸水靖依 2,固定有披3 - HCG IS 的 NC!膜 3,冻干金标记抗皿-HUG琅璃纤难4. 拔尿踱璃纤锥 5、试剂质控旺带 6、固定的抗H HCT抗体区若了.岐质塑料底板早

38、孕诊断用的免疫层析试纸条（通常又叫尿妊纸条）的装 配结构见图一。装配方法：在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标 记抗a - HCG玻璃纤维、已固定有抗p-HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按 图装配，配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状，即为尿妊用纸条。本法检测速度快，一般一两分钟可出结果；灵敏度高，可达50IU/L ;好的 试纸条结果也是准确可靠的，这是其所以能在尿妊诊断中得到广泛应用的主要原 因。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，但与原材料选 择特别是NC膜的孔径大小密切相关，准确性取决于抗p- HCG的特

39、异性。金标尿妊纸条虽然好用，但在使用中也必须注意以下几个方面：一是温度， 试纸条虽然可在室温保存，但大批暂时不用的试纸条还是应该放在4。保存，以 免抗体失效，从冰箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温，然后才打开密封， 可避免反应线模糊不清。二是正确操作，一般的操作方法是在试纸条的吸尿玻璃 端滴入2滴（约10 0微升）尿液，或将吸尿端直接插入标本中，深度约10 15毫米2 0秒，取出后平放，这种方法比较麻烦且容易造成污染。我们的方法 是取尿标本约0.5ml加入小试管中，然后插入试纸条，待12分钟反应带清 晰后观察结果。胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用ELISA法在临床实验室已得到普遍的应用，特别是

40、用于各型肝炎标志物 的检测。但ELISA法由于操作程序复杂，时间较长，给实验室带来不便。因 此出现一步法快速检测试剂盒，虽可提高检测速度，但有出现假阴性结果的弊端。 ELISA法需时较长的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗体）需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应不适当地缩短反应时间，将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要，近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，快速斑点渗滤法即为其中一种，其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法Dot-immunogold filtration assay），又称滴金免疫法。快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体：固定于

41、膜上的特异性抗原+标本中的相双顼目模式图五、省二中K点为检倒结果，小点为试削质控点。 图中4为阳性结.果，B为明性结果，为试剂失 效.图三中横杠为槌剥绿果,小点为试捆质控点。 图中A为阳怕始果，E为阴性纬果，C为试剂失 加图四中竖杠为检测结果，横杠为试剂质按点。 图中身为阳性站果，B为朋悝结果，C为试削发 败.图五中左大点为甲硕日橙剖结果，右大点为己 项日检浏结果,小点为试招磁控点，图中A为甲己 两个项口郡阳性.B为甲项白阳性，?为巳顼目阳 检，。为简个项目都是阴性，F为试剂火散，应抗体+金标记的抗抗体或SPA显色。夹心法测抗原：固定于膜上的多克隆抗体+标本中待测抗原+金标记的特异性单克隆抗体显色。结果判断：快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可直接观察结果。根据测定模式的不同可有以下不同的判定结果。快速斑点免疫金渗滤法检测速度快，结果观察一目了然，已应用于多种临床检测项目。以上分析可以看出，胶体金标记技术是继三大标记技术之后，又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技 术。反回主页我要发言