应用于 DMXNET 系统的 LED 灯具的开发

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1、青岛大学研究生学位论文应用SELDI-TOF-MS技术筛选初期胃癌血清生物标志物研究姓名：李春伟申请学位级别：研究生专业：一般外科指引教师：张佃良0517应用SELDI-TOF-MS技术筛选初期胃癌血清分子标志物研究摘要目的：应用表面加强解吸电离一飞行时间质谱(surface-erthancod laser desorptionionization timeof-flight mass spectrometry，SELDITOFMS)技术对胃癌患者血清蛋白指纹图谱进行分析，筛选候选肿瘤标志物以建立诊断模型，寻找更可靠的评价原则用于初期胃癌诊断和临床分型以指引个体化治疗，旨在进一步提高对 肿瘤分

2、期和预后的判断，以更好地监测治疗效果。措施：表面加强解吸电离一飞行时间质谱技术及其配套蛋白质芯片检测169例胃 癌患者和83例健康人的血清蛋白质组图谱，运用Biomarker Wizard TM和 Biomarker PatternsTM软件分析解决数据筛选具有明确临床价值的分子标记物或其 组合，以进行初期分子诊断并建立胃癌诊断分类树模型。 成果：胃癌组血清与正常人血清蛋白质谱共有34蛋白体现存在记录学差别 (pO05)，其中2873 mz，3163 mz，4526 mz，5762 mz，6121 mz和7778 mz 蛋白质峰构成诊断模型I，可将胃癌与正常人对的分组，敏捷度、特异性分别为 9

3、349、9157；此外，2873 mz，6121 mz和7778 mz蛋白质峰构成诊断模型 II，可将初期胃癌与iiiiiiv期胃癌，其敏感性和特异性分别为8936(4247)、 9262(113122)。结论：运用SELDI-0F-MS技术在人血清中可以筛选到初期胃癌迅速诊断的特异 性标志物，建立初期胃癌诊断的蛋白质模型；该措施在胃癌诊断特别初期胃癌诊断 方面具有重要的价值，值得进一步研究。研究生研究生：李春伟一般外科 指引教师：张佃良专家主任医师核心词：胃癌分子标志物表面加强解吸电离一飞行时间质谱蛋白 质组模式y2 “0 m4n”3哺删9眦4、呱8Analysis of serum bio

4、markers screening for diagnosis of stage I gastriccancer using SELDI-TOF-MSAbstractObjective：To make a proteomic analysis using surface-enhanced laser desorptionionization timeof=-flight mass spectrometry(SELDI-TOFMS)on the serum of stage I gastric cancer patients and establish a early diagnostic mo

5、del for identifying stage I gastric cancer preliminarilyMethods：Serum samples from 1 69 gastric cancer patients and 83 age and gender-matched healthy individuals were analyzed by SELDI-TOF-MS Protein Chip array technologyThe resulting SELDITOFMS spectral data were analyzed using the Biomarker Wizard

6、 TM and Biomarker PatternsTM software to fmd differential proteins and develop a classification tree for gastric carlcerResults：A total of 34 mass peaks were identifiedSix peaks at mass：charge ratios(nVz)of2873，3 163，4526，5762，6121 and 7778 were used to construct the diagnostic model IThe model I co

7、uld effectively distinguish gastric cancel-samples from control samples，achieving a sensitivity and specifici够of 9349and 9157，respectivelyIn addition, we identified three of the six protein peaks at 2873，6121and 7778mz，which could construct the diagnostic model IIThe model II could distinguish betwe

8、en stage I gastric cancer and stage IIIIIN gastric CallCeT wim all accuracy of 9 172Conclusion：Diagnostic models of serums proteins detects by SELDI-TOFMS Protein Chip array technology correctly distinguishes gastric CanCglfrom controls，and has significance for screening stage I gastric cancfeT from

9、 stage IIgastric cancerSEI DIFOF-MS is a useful tool for the detection and identification of new proton markersKey word：gastric cancer biomarkers SELDI-TOFMSSerum Proteomic Patterns引言引言胃癌是消化系统常用恶性肿瘤之一，在世界范畴内为第四多发恶性肿瘤和第二 致死性肿瘤，值得注意的是几乎近三分之二的胃癌发生在经济欠发达的地区或国家， 涉及中国n喇。近年来，虽然随着上消化道造影、内镜活检、术前新辅助治疗、术后 综合治疗

10、等诊断水平的提高，胃癌五年生存率有所提高，但效果仍欠抱负。据报道， 初期胃癌(I期胃癌)五年生存率可达829、II期胃癌628、III期胃癌178、 IV期胃癌33，总体五年生存率20左右口嘲。一般觉得影响胃癌预后的重要因素是 肿瘤的分期，分期越早，预后越好；初期诊断胃癌是最有效减少死亡率、提高治愈 率的措施。因此，有必要对初期胃癌诊断的措施进行摸索和研究。目前，内镜活检、手术切除肿瘤进行病理学检查被觉得是胃癌诊断的金原则， 但这种技术具有诸多弊端，其缺陷如耗费时间长、费用贵、给病人带来诸多不适， 更重要的是，诸多病人得到明确诊断后，即发展成进展期胃癌甚至晚期胃癌，治疗 效果较差：此外，内窥镜

11、活检送病理或手术切除后送病理无法制定人口众多的筛查 方案睁。因此，有必要摸索研究创伤小、费用低、便于筛查，具有高度特异性和灵 敏度的肿瘤标志物进行初期胃癌的诊断。自进入20世纪80年代以来，人们已经开始在胃癌患者外周静脉血中寻找与胃癌 有关的生物标志物，以期可以对初期胃癌进行尽早诊断。目前发现与胃癌有关的肿 瘤标志物重要有癌胚抗原(CEA)和糖链抗原199(CAl99)、125(CAl25)、242(CA242)、 50(CA50)等睁103。但这些指标敏感性、特异性均较低，尚局限性于用来进行初期胃癌的 诊断。近来大量研究表白，单个肿瘤标志物尚局限性用于初期肿瘤的诊断，有不少学 者运用多种肿瘤

12、标志物构成一种蛋白质组诊断模型进行全身多种系统肿瘤的诊断， 例如肝癌n1刳、卵巢癌nH、乳腺癌n蝴1、肺癌乜4删、前列腺癌嘲训、膀胱癌D2刊、胰 腺癌1、食管癌明大肠癌1等疾病的差别蛋白质组学研究中发现多种疾病有关的候 选蛋白标志物。有关胃癌肿瘤标志物的研究也有所报道，只是目前所报道胃癌有关 标记物临床价值具有不拟定性，这一方面反映了许多研究规模较小，纳入病例数偏 少，随访时间较短，记录学报告差；此外目前报道的研究大多数分析单一肿瘤标记 物的临床价值，对联合应用几种标记的组合分析局限性。因此，还需要高质量的设计 科学的多中心实验以得出可靠的结论，急切需要迸一步研究。近几年，新兴的表面增强激光解

13、吸电离一飞行时间质谱(surface enhanced 1aserdesorptionionizationtime of flightmass spectrometry technology， SELDI-TOF-MS)技术为差别蛋白质组学研究提供了一种十分抱负的平台，同步也为全 身多种系统肿瘤标志物的研究提供了一种抱负的平台。SELDI-TOFMS技术是由日本 出名科学家田中耕一发明，美国Ciphergen Biosyetems公司进行进一步研究并使之1青岛大学研究生学位论文商品化。该系统由3部分构成：蛋白质芯片；芯片阅读器生物信息学。该技术 的原理是芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解

14、析后形成荷电离子，不同质 荷比离子在仪器场中飞行时间长短不同，而绘制出一张质谱图案，可以显示不同蛋 白的相对分子量等信息。(工作示意图i如下)。SELDI技术能迅速分析、解决大量质 谱图信息，将测得质谱图与正常人或某种疾病或者疾病不同阶段的原则图谱进行对 比，就能捕获该疾病不同阶段特异性的有关分子蛋白质。蛾麟辫图1 SELDI-TOF船工作示意图表面加强解吸电离一飞行时间质谱(SELDITOFMS)技术不同与老式的蛋白质组 学技术，有如下某些长处：(1)1次可以实现上万种蛋白质检测分析，迅速、简便、 易行、高通量、平行分析，； (2)需样品量很少，只需25-50个细胞所提取的蛋白 质即可； (

15、3)较高的信噪比； (4)可以对小分子量的蛋白质进行鉴定； (5)可以 和基因芯片成果进行比较分析，在蛋白质组和基因组之间建立联系；(6)应用多种 未明确性质的蛋白质或肽信号可联合构成诊断模型，对全身各系统肿瘤的初期诊断 比单一的肿瘤标志物更精确可靠，敏感性特异度更高等。SELDI-TOF-MS技术克服了 诸多老式蛋白质组学研究中无法解决的问题，实现了蛋白质芯片技术临床检测应用 的奔腾。高通量的质谱技术为寻找新的标志物用于初期肿瘤的诊断和监测治疗效果， 已经成为一种临床医学研究的新方向。本课题设计总路线如下图2。图2本课题设计总路线3资料和措施第一章资料和措施11研究对象选用我院及青岛市立医院

16、普外科5月至5月持续入院的原发性 胃癌病人作为研究对象。胃癌分期原则按American Joint Conunittcc on Cancer(7th ed， )。所有病人均为汉族，经病理证明为胃腺癌，入选病例排除原则如下：(1)年 龄不小于75岁；(2)患有神经性厌食、炎性肠病、免疫性疾病和内分泌疾患；(3)感 染；(4)幽门梗阻；(5)心力衰竭(心功能不小于3级)、肝衰竭(Child分级C级)、 肾衰竭；(6)近4个周通过外科治疗、内镜支架术、放射治疗或化学治疗；(7)经受 过可以严重影响新陈代谢或体质量的药物治疗。健康人血清标本取自本院健康查体 中心，排除原则同胃癌排除原则，并随访一年，无

17、胃癌病例发生。所有研究对象入 组前均获得病人或家属的知情批准，并通过医院伦理委员会的批准。12实验材料121重要仪器1STS-2脱色摇床(上海琪特分析仪器有限公司)2震荡器MSl Minishaker(广州仪科实验室技术有限公司(IKA Works Guangzhou ID NO：L0015003Refrigerated centrifuge(SIGMAType：115K)4Gi lson Pipette(上海肇嘉浜路590号)5pH meter(SARTORIUSPB20)6Electronic Balance(rag level)(SARTORIUSBS210S)7Tips P2，P20，

18、P200，P1000(AXYGEN)815 mlvial(AXYGEN)905 ml，15 ml Microcentrifuge tube(AXYGEN)10高速台式离心机型号：TGL-16B(上海安亭科学仪器厂)11加热磁力搅拌器(IKARHKTC)12Ul tra-low temperature freezer(-80摄氏度冰箱)(KELON型号：BCD一2 19wAK) 13一30。摄氏度冰箱(KELoN型号：BCD-219WAK) 14自动制冰机(automatic ice machines)(Grant：FM 70A)4青岛大学研究生学位论文15制去离子水机(or Millipore

19、)(PALLModel：PL5121)16SELDITOFMS仪器及其配套的弱阳离子互换芯片(WCX2)(购自美国Ciphergen公司)122重要试剂 1尿素(urea) 2乙睛(CAN)3三氟乙酸(TFA)4芥子酸(SPA)5三经基甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液(TrisHCL)6经基呱嚓乙磺酸(HEPES)73一环乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)8无水NaAC9二硫苏糖醇(DTT) (以上试剂均购自美国Sigrma公司)10U9的配备-5ml：(9MUrea，50n!lMTrisHCl，2CHAPS，pH90) 称取2709 Urea(MW 6006，终浓度为9M)，加入HPLC H：O 3ml

20、和1M Tri sHCI 250ui pH90充足溶解；在上述溶液中加入CHAPS 01 g充足溶解；再用HPLC H：O定容至45ml， pH 90，加入DTT 0059，定容至5ml；分装入500ul离心管，每管100 ul，封口， 放入-80。C深低温冰箱保存。I iWCX-2 buffer的配备200ml：(50IIlM NaAC，pH40)称取无水NaAC 0829，溶 入180ml HPLC心O中；用HCI调pH40，HPLC H20定容至200 ml，4C保存。12其她试剂：HCL，HpLCHZO，生理盐水等。13实验措施131标本采集与解决所有病例及对照组均于上午抽取空腹静脉血

21、5ml，4C静置2h，然后于4C以 3000r：min离心lOmin，吸取上层血清分装，每管50ul，立即置-80。C深低温冰箱 保存。标本采集与解决示意见图11。5资料和措施I清晨空腹母取5llII全血U4静置静置2小时Ul 4以3湖t：min离心10mj琢量吸取上层血淆分装成每管50-JUI立即置一簟冰箱保存，图11标本采集与解决示意图，132血清样品解决1从80深低温冰箱中取出血清样品，放置冰盒上融解；2以10，000币m，4。C离心2分钟；3每个芯片点需要血清3ul，将血清样品冰浴振荡30分钟并用2倍体积U9缓冲液 稀释；5将9ul上述样品加入108ul相应的结合缓冲液中，使血清样品的

22、总稀释倍数达到 约40倍，混匀，避免产气愤泡。6将解决好的血清样品上样到芯片上。133芯片的选择常用芯片涉及WCX-2(弱阳离子互换芯片)、SAX2(强阴离子互换芯片)、 IMAC3Ni(固定金属亲和表面芯片)和H4(疏水芯片)等化学修饰芯片。其中研究发 现【32-33：化学修饰的WCX-2芯片，有弱阴型离子羧基结合其表面，通过与被分析 物表面正负电荷基团的互相作用而捕获蛋白，所得到的蛋白峰较多，蛋白分离效果 较好，且差别明显、稳定性强。本实验通过预实验验证上述芯片，成果现示WCX2 芯片所得到的峰最多、蛋白分离效果最佳、差别明显和稳定性强。预实验操作流程 (图12)。6青岛大学研究生学位论文

23、SEL翻嚣Q雾壤瞄嘲蟛娜蛐褂Sample1溯q警黧嘲炒图12 SELDITOFMS预实验操作流程134们x2操作环节1小心取出WCX-2的芯片，在芯片背后标记时间、芯片种类、人血清样品的姓 名等基本资料。2。将上述芯片装入生物芯片解决器(Bioprocessor)中。在组装生物芯片解决器 时，注意密封。一3在每孔中加入200ul结合缓冲液(50 mM NaAC，pH 40)，置振荡器400-600 转，分并震荡5分钟，再甩掉缓冲液。反复操作一次。操作时，注意保持芯片每 个点表面湿润；加缓冲液后要注意观测芯片表面有无气泡，如果有气泡产生， 用取液器吹去，其枪头不要接触到芯片上各点的表面。4上样，

24、在芯片解决器每个孔中加入解决好的血清样品lOOul，置振荡器400600 转，分。4C震荡1小时。5甩出样品，然后将甩出的样品甩入预先装有消毒剂的容器内。6每孔加入结合缓冲液200ul，(50 mM NaAc，pH 40)，置振荡器(400-600转，分，4震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入200ul结合缓冲液，反复上述 操作一次。7_-_-_-_-_l-_-_-_-_-I_-一。窒型塑查鲨7每孔加入HPLC水200ul，然后立即甩出。8迅速拆开芯片解决器，取出芯片待干后，在每孔上加SPA 05 ul，干后在反复 加SPA05ul一次。9待干后，即上机测定。实验操作流程示意图见图13。图13

25、SELDI-TOF-MS实验操作流程示意图青岛大学研究生学位论文14数据的采集与成果分析：运用PBS-C型蛋白质芯片阅读仪读取数据，每日用原则多肽和原则蛋白质分子 校正仪器。蛋白质芯片阅读器设立如下：检测敏感度8，激光强度165，优化蛋白质 荷比范畴30000kDa，最低信噪比为5，每个样品收集50个点。采用Biomarker Wizard软件分析胃癌组与健康对照组血清蛋白质谱差别，两组之间蛋白峰比较采用 t检查，拟定两组之间PO05时具有记录学意义；采用BiomarkerWizard软件分析初期胃癌组与健康对照组、IIIIIIV期胃癌对照组血清蛋白质谱差别，三组之间 蛋白峰比较采用秩和检查，

26、拟定三组之间PO05时具有记录学意义。所测数据采用 SPSSl30软件分析，计量资料以iS表达，采用t或秩和检查。9成果第二章成果21实验对象一般临床资料根据入院纳入及排除原则，符合条件的I期胃癌47例；并根据年龄、性别相匹 配的原则，随机选用II期胃癌39例、III期胃癌46例、IV胃癌37例、健康人83 例作为对照组。一般临床资料见表21。表21初期胃癌组与对照组一般临床资料注：I期胃癌与健康人、IIIIIIV期胃癌三组间性别、年龄无记录学意义。22 WCX-2芯片蛋白质谱的反复性测定SELDI-TOF-MS质谱技术反复性测定用质控标本进行，分别在将同一标本、同一 芯片上八个点同步检测(批

27、内)，并且在非同日检测的每个芯片上分析(批间)，获得 蛋白峰位置批间和批内变异系数分别为005和004；蛋白峰原则化强度(峰高) 批间和批内变异系数分别为14和11；每日仪器操作及抽样无明显差别，本研究结 果的可靠性可以得到保证。(见图21)2湖，嘲?S00tOOO笳协5o雄抡“圳|i蚓嘲矧_叫删j纠一2550750lO嘲图21不同WCX-2芯片不同步间检测同一血清样本的蛋白质图10青岛大学研究生学位论文注：横坐标为所测蛋白质的质荷比，纵坐标为所测蛋白质的相对丰度；所用的质控 血清在不同步间、不同的WCX-2(弱阳离子互换芯片)芯片进行反复性实验，显示 所测蛋白质的峰值无明显变化。23胃癌和健

28、康人之间血清中差别蛋白的检测用Biomarker Wi zard软件对169胃癌组与83例健康人组两组血清蛋白质质谱 图进行比较，成果显示在质荷比范畴-30000kDa范畴内共检测出34个差别蛋白 质，将差别蛋白峰导入Biomarker Pattern记录分析软件，对胃癌组与健康人组进 行记录分析，成果发现质荷比分别为2873mz、5762 mz、4526 mz、6121 mz、 3163 mz、和7778 mz的6个差别蛋白具有明显性差别(P005)(表22)，可组 成的诊断模型I，可以对的地将胃癌患者与健康人分组，敏感性和特异性分别为 9349(158169)、9157(7683)。它们在

29、质荷比横坐标上的分布如图22。表22胃癌和健康人之间血清差别蛋白的相对含量的比较注：f为胃癌血清中高体现的蛋白，I胃癌血清中低体现的蛋白；胃癌和健康人之 间血清差别蛋白的相对含量的比较具有记录学意义，P(t-test)005。24 I期胃癌和IIIIIIV期胃癌之间血清差别蛋白的检测在相似条件及参数下，对47例I期胃癌患者与122例IIIIIIV期胃癌患者6 个蛋白质进行对比研究，成果发现质荷比分别为2873、6121、和7778 mz的3个 差别蛋白具有明显性差别(PO05)(表23)，可构成的诊断模型II，可以对的地 将I期胃癌患者与IIIIIIV期胃癌患者分组，敏感性和特异性分别为 89

30、36(4247)、9262(113122)。它们在质荷比横坐标上的分布如图23。健康 人血清蛋白质谱分布如图24，I期胃癌和IIIIIIV期胃癌血清蛋白质谱分布如图25。成果 表23健康人、I期胃癌和IIIIIIV期胃癌之间血清差别蛋白的相对含量的比较注：f为胃癌血清中高体现的蛋白，I胃癌血清中低体现的蛋白；健康人、I期胃 癌和IIIIIIv期胃癌之间血清差别蛋白的相对含量具有记录学意义，PO05(秩 和检查)。图22胃癌和健康人之间血清差别蛋白的体现注：横坐标为所测蛋白质的质荷比，纵坐标为所测蛋白质的相对丰度。此图为胃癌 与健康人之间血清差别蛋白的体现。青岛大学研究生学位论文 健康人、初期胃

31、癌、IIIIIIV菇之间血清差别蛋白的体现ZU18Z1614魁12口健康人#10侠罂8Fl iiiiiIV期胃癌6T4T21-llU2873 f6121 f7778 lmz成果注：横轴代表蛋白质荷比，纵轴代表蛋白相对强度。此质谱图显示健康人血清蛋白 质谱的体现。图25 I期胃癌和III I IIV期胃癌之间血清差别蛋白的体现注：横轴代表蛋白的质荷比，纵轴代表蛋白相对丰度。此质谱图显示I期胃癌和 IIIIIIV期胃癌之间血清差别蛋白的体现。质荷比为2873mz、5762 mz、4526 mz、 6121 mz、3163 mz、和7778 mz 6个差别蛋白均在胃癌患者中异常体现；质荷比 分别为2

32、873mz、6121 mz、和7778 mz的3个差别蛋白均在I期胃癌患者中异常体现。14讨论第三章讨论目前，胃癌被觉得是一种多基因，多环节的复杂性疾病，其发生发展是多种基 因突变的过程。基因异常突变有也许会引起蛋白质水平的变化；人血清是一种相称 丰富并不断变化的蛋白质系统，单一分子标记物难以追溯到有关的细胞、组织，而 发现一组与特定细胞、组织癌变有关的血清蛋白质并对其进行研究有也许直接获取 疾病有关的特性性分子标志物。以蛋白质构成成分为研究对象的蛋白质组学的措施 为肿瘤初期诊断的研究提供了新的思维模式。从理论上说，任何疾病在浮现病理改 变之前，其细胞、组织和体液中的蛋白质成分及数量都会有相应

33、变化。近来研究表 明，血清、尿液、淋巴液等体液中具有大量与疾病有关的特异性分子标志物，特别 是血液中也许具有大量尚未被发现的可用作疾病初期诊断的多种分子标志物口训。3、1蛋白质组学的定义及研究措施一近年来，随着人类基因组筹划全面发展及完善，后基因组筹划的概念被许多著 名科学家提出，并将研究重点集中蛋白质水平。蛋白质组(proteome)源于蛋白质 (Pprotein)和基因组(genome)两个词的组合，是由澳大利亚出名科学家Wilkins和 Viiliams在1994年在乎大利一次国际蛋白质组学研讨会上第一次提出，重要是指 细胞内所有蛋白质的存在形式及其活动方式，后来引申为一种基因组所体现的

34、全套 蛋白质，而一种基因组可涉及一种细胞乃至一种生物1。目前，蛋白质组的确切定 义是：一种细胞、组织或生物体拥有的全套蛋白质，它不仅在同一机体的不同组织和 细胞中不同，并且在同一机体不同生理状态、不同发育阶段及不同外界环境下也有 不同驯。蛋白质组学(proteomics)是一门新兴的学科，以蛋白质组为研究对象，大规模、 系统地研究蛋白质的特性及微细构造m1，特别是蛋白质分子水平的研究，涉及蛋白 质体现、蛋白质间互相作用、翻译后修饰等，由此获得疾病发生发展过程、细胞生 理生化特性和调控网络广泛、完整的结识。随着蛋白质组学研究，差别蛋白质组学 越来越受到科学家注重，并通过疾病组和对照组的比较分析，

35、其在疾病研究中的应 用潜能得到充足展示，从而获得对于疾病发生发展及细胞代谢整体过程全面的结识 C4t。蛋白质组学最大的优势是可以在实验中观测一种或一组蛋白质或蛋白质亚型在 特定期间下，其在生理或病理状态所发生的相应变化H引。32蛋白指纹图谱技术在肿瘤研究中的应用蛋白指纹图谱技术最早是由许洋博士于本世纪初在中国提出，并于8月 在亚太地区国际肿瘤生物学和医学暨第21届国际肿瘤标志物学术会议和 年4月美国第96届肿瘤年会上正式报道蛋白指纹图谱技术在中国的应用。蛋白15青岛大学研究生学文论文指纹图谱仪技术的原理：芯池中的分析物在激光脉冲辐射的作用下，解析后形成荷 电离子，不同质荷比离子在仪器场中飞行时

36、间长短不同，而绘制出一张质谱图案。 将所检测人的蛋白质图谱与正常人原则图谱相对照，分析有无差别，就懂得这个人 的图谱是与否患有某种疾病，或是存有某一种或一组尚未探明的新的特异性分子标 志物。几十分钟或几分钟就可以完毕整个质谱的测定过程，十分迅速，措施敏感、 特异性高，同步一般不会破坏所测定的蛋白质化学构造。蛋白指纹图谱技术通过对蛋白质动态、全程的分析观测，对疾病初期微小变化 进行摸索，将病人全套血清蛋白质变化记录下来：绘制成蛋白指纹图谱就可以显示 所测样品中多种蛋白质不同信息，并将这张图谱原则图谱进行对照，就能发现捕获 到与疾病有关的、新的、敏感性特异性高的血清蛋白质及特性。33应用SELDI

37、-TOF-MS筛选结胃癌或初期胃癌血清蛋白标志物近年来，SELDI-TOF-MS技术在多种肿瘤的研究中已经得到越来越多的应用。临 床医学研究表白，初期发现是肿瘤治疗的核心，筛选特异性敏感性高的肿瘤有关生 物标志物对肿瘤的初期诊断和治疗具有重要意义。SELDITOFMS技术重要由蛋白质 芯片、芯片阅读器和生物信息学3大部分构成，具有操作简便、检测迅速、多样本检 测、敏捷性和特异性高等长处。根据美国国立肿瘤研究所多中心的三期临床实验得 出结论：SELDI-TOF-MS技术是目前最有但愿的对肿瘤进行初期检测诊断的技术。在 蛋白质组学研究中，蛋白质的分离技术、质谱技术和蛋白质数据库的进步完善，将 对初

38、期肿瘤进行诊断的研究有着重要作用。本实验结合蛋白质组学技术和蛋白指纹图谱技术，运用SELDITOFMS技术对实 验组I期胃癌47例、对照组II期胃癌39例、III期胃癌46例、IV胃癌37例、健 康人83例血清样品进行蛋白检测，成果发现质荷比分别为2873mz、5762 mz、4526 mz、6121 mz、3163 mz、和7778 mz的6个差别蛋白指纹图谱具有明显性差别(PO01)，可构成的诊断模型I，可以对的地将胃癌患者与健康人分组，敏感性和 特异性分别为9349(158169)、9157(7683)。除此之外，更重要的是6种蛋白 质中其中3种质荷比为2873mz、6121 mz、和7

39、778 mz的3个差别蛋白指纹图谱 具有明显性差别可构成的初期胃癌诊断模型II，可以对的地将I期胃癌患者与 IIIIIIV期胃癌患者分组，敏感性和特异性分别为8936(4247)、 9262(113122)。我们还需要进一步多样本多中心验证我们的胃癌诊断模型和初期 胃癌诊断模型，但愿能尽快推向临床应用。一、Lti HB蜘等学者报道了2046 mz，3179 mz，1817 mz，1725 mz和1929 mz五种蛋白质构成的胃癌诊断模型，可以把胃癌组与正常人分组，且一种质荷比为16讨论4665mz得蛋白质可以把III期胃癌和IIIIV期胃癌分组，敏感度和特异性分别 为916(1 112)和95

40、4(2122)。此报道与我们的研究成果有所不同，其因素可 能是所检测的分子量范畴不同样，她们分子量范畴(1500“20，000 mz)不同于我们 的(2，00030，000 mz)。Matthias等人运用SELDITOF-MS技术建立初期胃癌诊断 分类树，敏感度为889(89)，病例数较少，但也为我们大样本、多中心的研究 指明了研究胃癌初期诊断的方向。SuH53等学者运用类似技术也建立了胃癌诊断的蛋 白质模型，敏感度、特异性均较高，她们所用芯片为SAX2不同于我们的wcX一2，目 前对于那类芯片好尚没有权威性定论，我们通过预实验比较，选用WCX一2芯片蛋白 质谱体现更清晰。Liang呻1等学

41、者证明通过研究蛋白质组学技术建议蛋白质模型可以 对的把胃癌及正常人分组。我们的研究不仅把胃癌与正常人分组，更重要的是也对 初期胃癌与iiiniv期胃癌分组，可以对初期胃癌进行诊断，从而提高胃癌治愈 率，改善预后。本研究采用回忆性及前瞻性队列研究，立足于整体角度，对目前报道的肿瘤标 志物在重要人肿瘤中以单一或新的组合形式进行大规模验证，筛选，进一步采用血清 蛋白质组的措施试图寻找新的肿瘤标记。建立以血清蛋白标记为主的人恶性肿瘤早 期诊断，分子分期指标体系与有关原则，国内外未见类似大规模的研究报道。我们 使用SELDL-TOF-MS研究人恶性肿瘤血清特异蛋白标记，系统筛选有关标记物及其组 合，将可

42、以提高诊断的精确性。有也许发现更加精确和可反复的诊断措施，从而筛 选出用于人恶性肿瘤初期诊断的方案。对这些分子的纯化、鉴定等进一步分析可以更 进一步地理解肿瘤发病机理，同步为药物、生物治疗肿瘤提供重要的耙点选择和理论 支持。人恶性肿瘤的发生、发展及转归常常与该肿瘤胚胎发育和胚胎细胞与组织分化 限度有关。目前临床上存在分期与分型一致但治疗效果不同的状况，通过大规模系 统筛选将在老式措施基本上发现与临床治疗效果有关的也许具有不同发病机制的肿 瘤新型分类原则，更注重肿瘤质的变化，建立新型人肿瘤的分子定义，特别是引入 耐药基因检测，从而对肿瘤个体化治疗以及发病机制的摸索更具有重要意义；并将是 制定新的

43、肿瘤分期方案，提高人肿瘤治疗效果的重要根据。新型标记及其新组合的 临床意义的发现对涉及成人恶性肿瘤在内的所有肿瘤的研究将具有重要启示价值。34面临的闯题与展望近年来，各国出名科学家涉及不少诺贝尔获奖者，对肿瘤在分子生物学方面的 行为、特性进行了大量的研究摸索，获得了多项非常有价值的研究成果，但这些研究 成果在减少肿瘤发生、减少肿瘤引起死亡等方面效果不明显。美国肿瘤学界曾经公 布一项权威性的比较研究，显示自上世纪70年代以来，虽然不断有新的初期肿瘤诊17青岛大学研究生学文论文断和检测治疗效果的措施问世，但是全世界初期肿瘤诊断率及肿瘤致死率并没有显 著改善。表面加强解吸电离飞行时间质谱(SELDI

44、TOF_MS)技术在初期胃癌诊断的差别 蛋白质组学研究中，虽然优于老式的蛋白质分析技术，但在临床实际运用中仍面临 严峻挑战，其局限性如下：不能对所检测的蛋白质直接进行鉴定，对蛋白质性质、空 间构造、功能等研究仍需要依赖老式的蛋白鉴定技术，如激光解析离子化质谱仪、 生物信息学、二维电泳、基质辅助等。质谱信息的分析解决及分子生物信息学的广 泛应用尚有待进一步研究，芯片制备质量均一性、质控方面及实验反复性评价等问 题的研究尚有待完善。随着芯片技术、质谱分析技术及蛋白质分离纯化技术的发展， 以及在研究措施上新的突破和分子生物信息学工具的不断完善，在更高水平上寻找 新的肿瘤有关功能蛋白组和标记物成为也许

45、，从而在肿瘤发生机制、诊断、分期和 治疗效果检测中获得重大突破，同步也为探寻新的诊断措施和治疗靶标提供有力依 据，也为胃癌的研究、初期诊断和初期治疗带来新的曙光。通过差别蛋白质组学的 研究，寻找和确立一组初期肿瘤有关的蛋白质特异性分子标志物，这些分子标志物将 有也许成为发现初期肿瘤的“利器。结论结论=口 J，匕本研究提示：运用SELDI-TOF-MS技术在血清中可以筛选到诊断胃癌的特异性蛋 白质标志物，该措施在胃癌诊断特别初期胃癌诊断方面具有重要的价值，为初期胃癌 的诊断指明研究的方向。19参照文献参照文献1Yang L，Parkin DM，Ferlay J，Li L，Chen YEstima

46、tes of cancer incidence in China for and projections for Cancer Epidemiol Biomarkers Prey Jan，14(1)：2435 o2Yang LIncidence and mortality of gastric cancer in ChinaWorld J Gastroenterol Jan 7：12(1)：17203Spataro V，Genoni M，Maurer C，Muller WStomach cancer：lO yearsexperience with surgical treatment and

47、possibilities for improving the prognosisHelv Chir Acta 1993， 59：5895954Cenitagoya GF，Bergh CK，KlingerRoitman JA prospective study of gastric cancer Real5-year survival rates and mortality rates in a country with high incidenceDig Surg 1998，15(4)：317225Maruyama K，Okabayashi K，Kinoshita TProgress in

48、gastric cancer surgery in Japanand its limits of radicalityWorld J，Sur91987，11：418256Bunt AM。Hermans J，Smit VT，van de Velde CJ，Fleuren GJ，Bruijn JA Surgicalpathologicstage migration confounds comparisons of gastric cancer survival rates between Japan and Western countriesJ Cl in Oncol 1995，13：19257J

49、ankowski JA，Odze Pd)Biomarkers in Gastroenterology：Between Hope and Hype Comes Hi stopath0109yAm J Gastroenterol May，104(5)：1093-68Qiu MZ，Lin JZ，Wang ZQ，Wang FH，Pan ZZ，Luo HY，Li YH，Zhou ZW，He YJ，Xu RHCutoff value of carcinoembryonic antigen and carbohydrate antigen 199 elevation levels for monitorin

50、g recurrence in patients with resectable gastric adenocarcinoma Int J BiolMarkers Oct-Dec，24(4)：258649Marrelli D，Roviello F，De Stefano A，et a1Prognostic significance of CEA，CA 19-9 and CA 724 preoperative serum levels in gastric carcinomaOncology 1999，57：556210Carpelan-Holmstorm M，Louhimo J，Stenman堋

51、，Alfthan H，Haglund CCEA，CA 199 and CA724 improve the diagnostic accuracy in gastrointestinal cancershnticancer Res ，22：2311611Kim J，Kim SH，Lee SU，at a1Proteome analysis of human liver tumor tissue by twodomensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorptionionization mass spectrometry

52、for identification of disease related proteinsE1ectrophoresis 。23：4142415612Zinkin NT，Grall F，Bhaskar K，et a1Serum proteomics and biomakers in hepatocelluarcarc inoma and chronic l iver di seaeCl in cancer res ，14：470477青岛大学研究生学位论文 13Petricoin。EF，Ardekani，AM，Hitt，队，et a1Use of proteomic patterns in

53、serllmto identify ovarian cancerLancet，359：57257714Kim JH，Skates SJ，Lege T，et a1Obsteopontin as a potential diagnositic biomarker for ovarian cancerJAMA，287：1671167915Jones岫，Krutzsch H，Shu n，et a1proteomic analysis and identification of new biomakers and therapeutic targets for invasive ovarian canc

54、arProteomic， 2：7684，16Zhang Z，Bast RC，Yu Y，et a1Three biomarkers identified form serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancerCancer Res， 64：5882589017Kong FB，White CN，Xiao XY，et a1Using proteomic approaches to identify newbiomarkersfordetetionandmonitoringofovarionancerGy

55、necol Oncol，100：24725318Li J，Zhang ZProteomics and bioinformatics approaches for identification of serumbiomarkers to direct breast cancerCl in Chem，48：1296130419Carter DDauglars JF，Cornellison CD，et a1Purification and Characterization of the mammglobinipophilin B complex，a promising diagnostic mark

56、er for breast cancerBiochemistry，41：6714672220Mathel in C，Cromer A，Wendl ing C，et，a1Serum biomarkers for detect ion of breastcancers：a prospective studyBreast Cancer Res Treat，2：卜821Gravett MG，Novy MJ，Rosenfeld RG，et a1Diagnosis of intra-amniotic infection by proteomic profiling and identification o

57、f novel biomarkersJAMA，292：462-4622Clarke ClI，Buckley JA，Fung ETProteomi cs of breast cancerCl in Chem Lan Med ， 43：1314-132023Ru Z，Jian-Guo J，Yuan-Peng T，et a1Use of serological protemomic methods to find biomarkers associated with breast cancerProtemics ，3：43343924Brichory F，Beer D，Le F，et a1Proteomics based identification of protein gene product 95 as a tumor ant igen that induces a humoral immune response in lung cancer Cancer Res，61