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1、近代物理实验报告实验4-1荧光光谱【摘要】激发态分子返回基态而产生光辐射的跃迁，称为辐射跃迁，即荧光。本实验利用 RF-5301PC荧光分光光度计测量了不同浓度的维生素B2溶液的光谱特性。固定激发光波长， 扫描发射光波长，得到荧光发射光谱；固定发射光波长，扫描激发光波长，得到荧光激发光 谱。【关键词】荧光，光谱，激发，发射原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出 一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指 分子荧光。以物质发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行定量分析及以荧光光谱 的形状和荧光峰对应的波长进行定性分
2、析的方法称为荧光分析法。在荧光分析中，将荧光分 为自然荧光和人工荧光，本实验所述荧光为自然荧光，即无须经过处理，当受到激发光照射 时就能产生荧光的现象。实验目的理解并掌握荧光产生的机理。学会测定不同浓度物质溶液的荧光激发光谱和发荧光射光谱。 了解影响荧光产生的几个主要因素。实验原理原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出 一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指 分子荧光。1. 产生过程（如图1）. 光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态。此时，荧光分子处于激发态。. 内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃
3、迁过渡到低的能级。.外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移， 过渡到低的能级. 荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的 分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。系间转换：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间。能量发射磷光振动她豫图12. 光谱特性 激发谱：固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲 线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。 发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。1）S
4、tokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的 长，振动弛豫消耗了能量。2）发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态， 产生波长一定的荧光。3）镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称 关系。4）荧光寿命和荧光量子产率。去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是以指数形式衰减。定义荧光强度降低 到激发状态最大荧光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。荧光寿命是个很重要的参数， 可以不再对荧光的绝对强度进行测量。荧光寿命方程：F
5、= Foe /TQ为量子产率，为荧光发射速率，为非辐射转移速率，Tn为荧光自然寿命.通常量子效率和 波长相关，但生化的荧光通常和波长无关。Z=l/3. 影响荧光分析的几个主要因素：样品温度的影响：降低体系温度可以提高荧光量子产额。样品的光化反应：光化反应使荧光强度降低。杂散光干扰：散射光来自激发光溶剂分子的散射（瑞利散射）或被小颗粒或气泡的散射。通过在发射单色仪前和激发单色仪后插入相应的短波截止滤光片来消除。溶剂的影响：增加溶剂的极性，有利于荧光的产生。溶剂的拉曼散射光：当溶剂具有拉曼活性时，在激发光长波边会出现类似荧光的拉曼散射峰。样品浓度效应：浓度高时荧光强度下降，需要校正。样品污染的影响
6、：轻微的污染都会影响测量的准确度。溶解氧的影响：溶解氧对一定样品有明显的荧光消光效应（猝灭）。pH值的影响：弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上不同，是不同的型体，各具有特殊的荧光量子产额和荧光光谱三、实验内容和装置实验装置如图2。激发单色仪将氙灯输入的连续光谱分理出单色光输出，作为激发光。激发光照射到样品单色光连续光谱激发单色仪激发光起伏信号上，样品发射的荧光则由发射单色仪进一步分光并被光电倍增管PM2接收OPM1用于监控氙灯 光源光强起伏。通过分束器获得激发光强起伏信号，并反馈到PM2电路中，这被称为光源补 偿系统。RF-5301PC型分光光度计的光学系统示于图3。实验步骤：1. 制备样
7、品：配置不同浓度维生素B2溶液：5卜g/ml，10卜g/ml，15卜g/ml，20卜g/ml， 25N g/ml 各 10ml ；2. 样品的激发光谱特性：选择400nm激发波长，对样品照射，然后扫描荧光发射波长，检 测荧光发射峰值波长。然后将单色仪固定于峰值波长上，对激发波长进行扫描，得到激 发光谱图像；3. 样品的发射光谱特性：激发光波长设置在激发光谱的峰值波长处，对被测样品照射，扫 描荧光发射波长。四、数据处理和分析1.维生素B2溶液浓度为5P g/ml发射波长为529nm的激发光谱选择激发波长为400nm时的发射光谱500600700发射波长800200激发波长为270商的发射光谱50
8、 -激发波长为375nm的发射光谱500600700800发射波长o40激发波长为451颓的发射光谱2.维生素B2溶液浓度为应g/ml选择激发波长为400m时的发射光谱 发射波长为523nn时的激发光谱激发波长_1激发波长为381 m时的发射光谱激发波长为277nn时的发射光谱o4080500600700发#长一00- _ _ _ _400 0 0 0 0 0 0 4 o o o o O 54321 4321Steffis激发波长为451m时的发射光谱004500600发就长7008003.维生素B2溶液浓度为15卜g/ml选择激发波长为400m时的发射光谱发射波长为528m时的激发光谱激发波
9、长发射波长激发波长为280m时的发射光谱soffit发射波长发射被长激发波长为468m时的发射光谱发射波长发射长发射波长为525nn时的激发光谱激发波长维生素B2溶液浓度为20卜g/ml选择激发波长为400nn时的发射光谱激发波长为284nn时的发射光谱 激发波长为378nn时的发射光谱400500600700800发射波长发射波长激发波长为468m时的发射光谱发蜒长5.维生素B2溶液浓度为25 g/ml选择激发波长为400m时的发射光谱激发波长为286皿时的发射光谱50发射波长为524m时的激发光谱400500600700800激发波长为374m时的发射光谱发射波长激发波长为468nn时的发射光谱6.当激发波长为400nm时，荧光发射光谱峰值强度与维生素驾溶液浓度的关系。激发波长为400 rm时的IC曲线I【参考文献】1 陈国珍，荧光分析法（第二版）科学出版社，19902 祝大昌，朱世盛等 分子发光法 复旦大学出版社，19853 夏锦尧 实用光谱分析法中国人名公安大学出版社，19924 赖文著，徐广智等译分子光谱学，高等教育出版社，19855 吴征铠，唐敖庆分子光谱学专论山东科学技术出版社，1999
荧光光谱实验报告
