斑蝥酸钠逆转K562AO2细胞多药耐药的机制初探

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1、实用肿瘤杂志2007年第5期斑蝥酸钠逆转K562/AO2细胞多药耐药的机制初探魏素菊 时爱春河北医科大学第四医院肿瘤内科 河北050011摘要 目的: 将斑蝥酸钠（SCA）作用于K562/AO2细胞，来逆转白血病细胞的多药耐药，研究其逆转机制。方法: MTT法测定阿霉素(ADM)对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）；逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mdr1基因水平;用流式细胞术（FCM）法检测P-gp蛋白表达的水平。结果: MTT结果显示,无毒剂量的斑蝥酸钠与ADM联合应用比单纯加ADM(同等剂量)对K562/AO2细胞的IC50降低了1.51倍；耐药细胞（K562/AO2

2、）加斑蝥酸钠前后mdr1基因与P-gp蛋白表达均下降。结论:斑蝥酸钠逆转K562/AO2对阿霉素的耐药的机制可能是它抑制mdr1基因和P-gp表达，使细胞内化疗药物积累增加。关键词 多药耐药逆转;斑蝥酸钠;机制 多药耐药(MDR)是恶性肿瘤化疗失败的最重要原因之一。研究表明，肿瘤细胞mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)的过度表达是导致肿瘤细胞MDR的重要原因。多年来人们一直致力于多药耐药的研究,但并未取得满意效果。本文通过斑蝥酸钠对K562/AO2细胞MDR的作用和机制研究,为中药逆转肿瘤的多药耐药提供试验依据。1.1 材料 细胞系和细胞培养：K562细胞:人红白血病细胞株(敏感株),由河

3、北医科大学第四医院科研中心提供; K562/AO2细胞:由K562细胞株经ADM诱导而成,由河北医科大学第四医院科研中心提供。K562细胞、K562/AO2细胞分别接种于含有10%胎牛血清RPMI-1640完全培养液（含青霉素100u/ml,链霉素100u/ml)中,37 、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，3-4天换液一次。K562/AO2细胞培养体系中加入终浓度为1.0ug/mL的阿霉素（ADM）以维持耐药性，实验前无药培养2周。 药物和主要试剂:速溶性阿霉素(Adriamycine, ADM):浙江海正药业股份有限公司产品;维拉帕米(Veral1amll,VRP):上海禾丰制药有限公司产品

4、; 斑蝥酸钠注射液（Disodium Cantharidinate，SCA）:贵州柏强制药有限公司产品。mdr-1单克隆抗体： 北京中杉金桥生物技术有限公司产品;四氮甲基唑蓝（MTT）:博海生物制品公司产品; Trizol：Invitrogen公司产品；DEPC：Sigma公司产品；RT Reagents，PCR Reagents，DNA Marker：TaKaRa公司产品；引物序列（北京塞百盛基因技术有限公司合成）：mdr1上游引物： 5-ACA CCC GAC TTA CAG ATG ATG TCT C-3；下游引物： 5-CGA GAT- GGG TAA CTG AAG TGA ACA

5、T-3 扩增产物为623bp；磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物： 5-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3；下游引物： 5-GAA GAT GGT GAT- GGG ATT TC-3 ；扩增产物为486bp。 主要仪器设备:CO2恒温培养箱:TC2323型，美国SHELDON公司产品; 756MC型紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品;全自动酶标分析仪：HT2型，奥地利公司产品； PCR扩增仪：PE9600型，美国PE公司产品；凝胶图象分析系统：法国VL公司BIO-PROFIF产品。1.2 方法斑蝥酸钠无毒剂量的筛选1：取对数生长期细胞K562/AO2，用

6、RPMI-1640调整细胞悬液浓度为1105/ml，接种于96孔培养板内,每孔含1104 个细胞(100ul/孔),培养24小时后，加入不同浓度的SCA100ul，置于二氧化碳孵箱中,37,培养48h后,每孔加入MTT20ul,继续培养4h,弃上清,每孔加入200u1DMSO,微量振荡器振荡10分钟,待蓝色结晶完全溶解后,酶标仪上测定570nm波长的吸光度（A570），经过回归分析,可得出斑蝥酸钠的无毒剂量,即对细胞抑制率小于10%时的药物浓度。 MTT法检测SCA对耐药细胞的逆转作用2、3：按上述方法调整好细胞浓度，接种于96孔培养板内,每孔含1104 个细胞(100ul/孔), 另设对照组

7、（不加药物，改用同量的培基）和空白对照组（不加细胞悬液，改用同量培基）。培养24小时后，并将不同浓度的ADM加入K562（ADM浓度0.16-10 ug/ml）和K562/AO2（ADM浓度5-320 ug/ml），50 ul/孔，加入抗癌药物前0.5h,分别加入终浓度为SCA（0.1ug/ml）或VRP（5ug/ml）50 ul。置于二氧化碳孵箱中,37,培养48h后,每孔加入MTT20ul,继续培养4h, 2000rpm，离心15min,弃上清,每孔加入200u1DMSO,微量振荡器振荡10分钟,待蓝色结晶完全溶解后,酶标仪上测定570nm波长的吸光度（A570）,计算细胞的生长抑制率、耐

8、药倍数、逆转倍数,实验重复3次。细胞生长抑制率=1-（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）100%耐药倍数=IC50（敏感细胞）/IC50（耐药细胞）逆转倍数(RF)= IC50（逆转前）/IC50（逆转后） RT-PCR法测定mdr-1基因表达：应用Trizol试剂提取总RNA;cDNA合成反应体系50ul,42反应60min;PCR反应体系50ul,94预变性4min,94变性45s,60退火45s,72延伸90s,32个循环后72再延伸10min;取PCR产物6ul,在1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳,结果在凝胶成像系统扫描并照相,计算mdr1/GA比值进行mdr1基因表达相

9、对半定量分析。 FCM 法检测SCA对细胞P-gp的表达的影响：按上面方法调整细胞浓度，接种于6孔板内，分别加入SCA（0，0.1ug/ml)或VRP（0，5 ug/ml）, 37,孵育24、48、72h,以冷PBS洗2次,收集细胞，加入100 ul的鼠抗人单克隆抗体（mdr-1），室温孵育30 min，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 ul,流式细胞仪检测。实验重复三次。统计学处理:数据以 s表示，所有数据采用SPSS12.0软件进行分析。2 结果2.1斑蝥酸钠非细胞毒剂量的确定 根据剂量效应曲线得出，SCA终浓度0.11 ug/ml 时,其对K562细胞和K562/AO2细胞均具

10、有较强的生长抑制作用,并呈剂量依赖性。当SCA的终浓度 0.11 ug/ml 时,其对K562细胞和K562/AO2细胞无明显生长抑制作用(细胞的存活率均90%),故以此浓度作为非细胞毒浓度。本实验采用的逆转剂量为0.1ug/ml。2.2 SCA对K562/AO2细胞药敏性的影响 非逆转条件下，K562细胞对ADM的IC50为0.62ug/ml；K562/AO2细胞IC50为40.85ug/ml，K562/AO2细胞对ADM的耐药倍数为65.89倍。当SCA与ADM连用时，SCA使K562/AO2细胞对ADM的IC50值下降到27.09ug/ml，RF为1.51倍；与VRP比较，SCA作用较弱

11、，两者有显著性差异（p0.05，表1）。表1 各实验组细胞对阿霉素的IC50值及逆转倍数（ s ,n=3）GroupIC50 (ug/ml)RFK5620.620.05-K562/AO240.850.40-K562/AO2+SCA27.090.631.51K562/AO2+VRP4.290.139.522.3 SCA对细胞mdr-1基因表达的影响 RT-PCR检测表明，K562细胞中无mdr1mRNA的表达；而K562/AO2细胞中mdr1mRNA的表达呈强阳性。以反映mdr1mRNA相对表达水平的mdr1/GA表示，K562/AO2细胞为0.470.01，当以SCA处理24、48、72h后,

12、 K562/AO2细胞的mdr1/GA分别为0.450.01、0.310.01、0.270.01。SCA处理前后相比较差异显著（p0.05，图1）。说明SCA能降低K562/AO2细胞中mdr1mRNA的表达水平，且呈时间依赖性。与VRP比较，SCA作用较强，两者有显著性差异（p0.05）。图2 细胞中mdr-1基因的表达的RT-PCR法检测M:DNA maker;1:K562细胞;2: K562/AO2细胞;3:K562/AO2细胞+SCA(24h);4: K562/AO2细胞+SCA(48h);5: K562/AO2细胞+SCA(72h);6: K562/AO2细胞+VRP(24h);7:

13、 K562/AO2细胞+VRP(48h) ;8: K562/AO2细胞+VRP(72h) .第一排为对照组，第二排为实验组。2.4 SCA对细胞P-gp蛋白表达的影响 药物作用前K562细胞组不表达P-gp，K562/AO2细胞组高表达P-gp，K562/AO2细胞组P-gp表达高于K562细胞组(P0.01)。SCA、VRP作用K562/AO2细胞24h、48h、72h后，P-gp表达量随着作用时间的延长而降低（p0.01），同一时间点SCA、VRP两组比较，斑蝥酸钠组的作用较弱(P0.05，图2)。图2 两实验组K562/AO2细胞P-gp 表达( s,n=3)3 讨论MDR就是指肿瘤细胞

14、经化疗药物作用后,不但对该种化疗药物,而且对那些从未接触过结构和功能完全不同的其它化疗药物也产生耐药性。肿瘤细胞MDR的产生是肿瘤治疗的主要障碍。关于MDR产生的机理目前还不特别明确,主要机制有:(1)膜转运蛋白超家族:P-gp、MDR相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等介导的MDR;(2)酶介导机制:谷胱甘肽硫转移系统(GSH/GST)功能增强、拓扑异构酶2(TOPO)活性下降;(3)细胞凋亡受抑制,Bcl-2等介导。目前,为克服MDR已进行了许多研究。许多药物可逆转MDR，如调节P-gp功能的药物:钙通道阻断剂、免疫调节剂等。但是,钙离子阻断剂、免疫抑制剂

15、等因较大的心、肾毒性限制了临床应用。十几年来,研究人员一直致力于寻找安全有效的逆转多药耐药的方法.作为中国国粹的中草药因其具有毒性低、副作用小等优点,在MDR的逆转研究中引起广泛的关注,它们的应用为MDR的逆转提供了新的策略,在肿瘤的化疗治疗方面展示了良好的前景.中药抗白血病由来已久,在与化疗联合应用中有着较好的增敏减毒作用。本文所采用的是临床上广泛应用的、具有增敏减毒作用的中药-斑蝥酸钠。目前观点认为MDR作用机制相当复杂，其中,P-gp介导的MDR是血液系统肿瘤多药耐药的主要机制4。P-gp是一种能量依赖型的外流泵,把细胞内的药物通过主动运输的方式泵到细胞外,使细胞内的药物浓度降到有效杀伤

16、浓度以下,从而产生了耐药性。而P-gp是mdr-1基因的产物,目前检测mdr-1基因表达主要从mRNA水平和蛋白水平进行。故本实验通过对细胞、RNA及蛋白3个水平的3个不同检测指标(IC50、mRNA及P-gp表达)的检测,来探讨斑蝥酸钠逆转K562/AO2细胞MDR的作用。K562/AO2细胞是典型的MDR细胞株，MTT结果显示，经斑蝥酸钠处理后，阿霉素对耐药细胞的IC50由40.850.40 ug/ml，降到27.090.63 ug/ml，部分逆转了K562/AO2细胞对阿霉素的耐药性，并且mdr1mRNA及P-gp蛋白的表达也较处理前明显降低。表明斑蝥酸钠能部分逆转K562/AO2细胞M

17、DR，逆转耐药的机制可能是通过抑制mdr1基因及P-gp蛋白表达，使细胞内化疗药物积累增加，从而逆转了K562/AO2细胞的耐药性。本实验采用维拉帕米作阳性对照组，结果显示斑蝥酸钠的逆转耐药性较维拉帕米弱，但由于斑蝥酸钠能减少放疗化疗引起的副反应，如升高白细胞，并能增强机体免疫力，在临床上将有广泛的应用前景。多药耐药机制十分复杂，目前尚未十分清楚，并且斑蝥酸钠逆转多药耐药机制研究尚处于体外研究的初级阶段，因此需要在以后的实验中从其他耐药机制方面上进一步探讨，进而在体内动物耐药模型中探讨，临床上验证。参考文献:1王天晓,张凤春,杨晓虹.敏药碱-G逆转肿瘤细胞多药耐药的作用和机制研究.Chin J

18、 Lab Diagn, 2005,19(2):184-186.2林秀梅,谢兆霞,秦群.甲基莲心碱、红霉素逆转K562/A02细胞多药耐药及其机制的研究.中华血液学杂志,2005,26(5):305-307.3白景清,沈朋,张洪妍.K562/A细胞阿霉素转运动力学参数与逆转倍数的相关性.Chin Pharm f.2005,40(10):766-769.4Sorneveld P.Multidrug resistance in haematological malignanciesJ.J Intern Med,2000,247(5):521-534. 基金项目:河北省科技厅立项课题(042761131)作者单位:050011 河北, 河北医科大学第四医院（魏素菊）