新冠核酸检测技术方案

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1、新冠核酸检测技术方案为落实国务院应对新冠疫情联防联控机制关于做好新 冠疫情常态化防控工作的指导意见（国发明电202014 号）和省应对新冠疫情应急指挥部要求，进一步提升全省新 冠核酸检测能力，全面推进扩大核酸检测，使新冠核酸检测 保“量”保“质”保“安全”，为做好常态化疫情防控工作 提供有力技术支撑,制订此技术方案。适用于XX省区域内开展新冠核酸检测的实验室。 二、生物安全防护要求（一）防护用品。医用外科口罩、N95及以上防护口罩、 全面型呼吸防护器或护目镜和面屏、医用防护服、防水隔离 衣、工作服、工作鞋、乳胶手套、防水靴套、医用防护帽。（二）相关操作过程人员生物安全防护要求。 样本采集 样本

2、核酸提取人员须三级生物安全防护：N95 口罩（必要时 可在外加戴医用外科口罩）、医用防护帽、工作服、外着防 护服（必要时加戴穿防水隔离衣）、工作鞋、防水靴套、双 层乳胶手套、护目镜（必要时可加戴面屏）或全面型呼吸防 护器。标本运输/接收人员须二级生物安全防护：工作服、工 作鞋、防水隔离衣、医用防护帽、医用外科口罩或 N95 口罩、 乳胶手套；特殊情况时，可升级为三级生物安全防护。核酸扩增检测人员须一级生物安全防护：医用外科口罩 乳胶手套、工作服、工作鞋、医用防护帽。三、人员要求（一）掌握实验室生物安全知识，熟悉生物安全三级实 验室个人防护操作。（二）实验室操作人员具备核酸提取和 PCR 扩增等

3、分子 生物学操作能力。（三）标本采集人员接受过新冠标本采集操作培训，实 验室检测人员接受过新冠核酸检测技术培训。新冠核酸检测实验室应至少设置三个区域：试剂准备区、标本制备区、核酸扩增区。各区域可以采用集中或分散设置 形式，但物理空间上必须完全相互独立，各区域在使用中应 当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。标本 制备区应为生物安全二级实验室，宜为负压。如为常压，应 当可以通风换气，同时，必须设置缓冲区，以满足实验室个 人防护装备穿脱的需求。五、核酸检测实验设备要求（一）试剂准备区。超净工作台，冰箱，混匀器，移液 器，离心机。（二）标本制备区。冰箱，混匀器，移液器，生物安全 柜，核酸提

4、取仪，离心机。（三）核酸扩增区。荧光 PCR 扩增仪。六、试剂耗材要求（一）核酸提取试剂和检测试剂需具备三证，并通实验 室性能验证。（二）移液器枪头应为带滤芯枪头。七、标本采集（一）采集对象。需要进行新冠核酸检测的个体。（二）采集准备。咽/鼻拭子、采样管、采样杯、三级 生物安全个人防护装备。（三）采集标本类型。新冠核酸检测的样本类型一般包 括上呼吸道的咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子，下呼吸道的深咳 痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液和肺组织 活检标本。为提高呼吸道样本的新冠核酸阳性检出率，兼顾 采样的便捷性，首选深咳痰，其次鼻咽拭子，最后才是咽拭 子,也可同时采集同一人的鼻拭子和咽拭子并放

5、入同一病毒 采样液中。（四）标本采集方法。1. 咽拭子：被采样人坐下，头后倾，张大嘴，并发“啊” 音。咽拭子越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处。先 用拭子适度用力来回擦拭双侧咽扁桃体至少 3 次，然后再咽 后壁至少 3 次。取出拭子，避免触及舌头、悬垂体、口腔粘 膜和唾液。将拭子头浸入含 3ml 采样液的管中。靠近顶端处 折断无菌拭子杆，尾部弃去，旋紧管盖。2. 鼻咽拭子：被采样人头部后仰（约 70。），保持不动。 用鼻拭子估测耳根到鼻孔距离。自鼻孔垂直面部方向插入， 深入距离最少应达耳垂部位到鼻尖长度的一半。遇到阻力后 即到达后鼻咽，应停留数秒吸取分泌物（一般要求1530s）, 应旋转拭

6、子35次。宜轻轻旋转取出拭子，拭子头浸入装 有 3ml 采样液中。顶端处折断无菌拭子杆，尾部弃去，旋紧 管盖。3. 深咳痰液： 用清水（勿用含消毒剂的漱口液）漱口 23 次，有假牙者取出假牙后漱口，要求病人深咳后，将咳 出的痰液收集于采样杯（含 3ml 采样液（细胞保存液）的 50ml 螺口痰杯）中。4. 支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插 入气管（约 30cm 深处），注入 5ml 生理盐水，接通负压， 旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液 冲洗收集器 1 次（亦可用小儿导尿管接在 50ml 注射器上来 替代收集）。5.肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或

7、鼻 经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支管，将其顶端契入支 气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次 3050ml，总量100250ml,不应超过300ml。送检标本管/杯外必须贴含样本编号、种类、姓名及采 样日期等信息的识别条码。在采样记录单上同时记录并张贴 识别条码。（五）标本运输。将密闭后的标本管/杯装入密封袋， 每袋限一份标本，依次装入标本盒、新冠专用标本转运箱， 并保持标本直立， 70%酒精消毒后封闭，并由专人转运到实 验室。转运期间不能自行打开转运箱，并保持转运箱平稳， 避免剧烈震荡、颠簸。内部转运时，应采集之后 30min 内运抵实验室，不宜超 过2h；涉及外部标本运输

8、的，应根据标本类型，按照A类或 B 类 感染性物质进行三层包装。宜冷藏条件下定时定点转 运交接，转运时间不超过 8h。标本采集后应置于41环境保存,保存时间不超过24h。（六）标本保存。用于病毒核酸检测的标本应尽快进行 检测，能在24小时内检测的标本可置于41保存；24小时 内无法检测的标本则应置于-701或以下保存（如无-701保 存条件，则于-201冰箱 暂存）。应设立专库或专柜单独 保存标本。标本运送期间应避免反复冻融。（七）标本接收1.确认样本在装箱前有消毒环节，并在开箱瞬间用 75% 乙醇喷雾消毒。2.核实样本信息。八、实验室检验（一）新冠核酸提取。在标本制备室，须 2 名实验室操

9、作人员着生物安全三级个人防护装备进行病毒 RNA 提取，确 保生物安全。进行核酸提取时，标本的开盖、取样或核酸的 人工提取等操作都在生物安全柜内两人配合进行，检验操作 过程中尽可能缩短打开样本管盖的持续时间，轻柔操作，尽 可能避免产生气溶胶。（二）新冠核酸检测。推荐选用针对新冠的 ORF1ab、N 基因区域的引物和探针。靶标一（ORFlab）:正向引物（F）： CCCTGTGGGTTTTACACTTAA反向引物（R）： ACGATTGTGCATCAGCTGA荧光探针（P）：5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQl-3靶标二（N）：正向引物（F）： GGGG

10、AACTTCTCCTGCTAGAAT反向引物（R）： CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG荧光探针（P）:5-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3核酸提取和实时荧光 RT-PCR 反应体系及反应条件参考 相关厂家试剂盒说明。结果判断：阴性：无Ct值或Ct 240。阳性：Ct值37,可报告为阳性。灰度区：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结 果 Ct 值40 ,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否 则为阴性。注：如果用的是商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书 为准。（三）阳性结果的认定。由卫生健康行政部门批准的确 认实验室进行阳性样本确认检测；非确

11、认实验室的结果阳性 须立即联系当地的疾控中心进行核酸结果的确认检测。实验 室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：1. 同一份标本中新冠2个靶标（0RFlab、N）实时荧光RT-PCR 检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结 果，则需要重新采样，重新检测。如果仍然为单靶标阳性， 判定为阳性。2. 两种标本实时荧光 RT-PCR 同时出现单靶标阳性，或 同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测 结果，可判定为阳性。核酸检测结果阴性不能排除新冠感染，需要间隔 1 天后 再次采样检测以确认。同时需排除可能产生假阴性的因素， 包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收 集

12、的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术 本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。（四）检验后标本及相关废弃物处理1. 需复查和上送的标本，应按规定保存和上送。否则和 其他固体废弃物一起装入红色废弃物袋内密封，转运至高压 灭菌室，高压灭菌。2. 相关废液，采用化学消毒或物理消毒方式处理，并对 消毒效果进行验证，确保彻底灭活。3. 消毒灭菌后的标本转运出实验室需符合生物安全原 则、符合感染管理规范。九、质量控制卫生健康行政部门批准同意开展核酸检测的实验室要 进一步制定和完善新冠实验室检测相关管理制度和工作程 序。严格按照国家卫生健康委新冠实验室检测技术指南（第 五版）和本技术方案，科学、规范开展样本采集、样本运输（院内和外部）、实验室检测、信息报送等各环节工作，确 保工作质量。各检测机构实验室需做好新冠核酸检测的日常室内质 控（包括不限于定期使用阴性、阳性和弱阳性质控品；仪器 比对；人员比对；试剂比对等）；并常态化接受国家或省级 质量控制中心的检测技术和质量控制指导。