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1、2.1.5 土壤线虫提取、分离与鉴定 线虫的淘洗过筛称取鲜土 100 g，用淘洗一过筛一蔗糖梯度密度离心方法分离线虫(Liang et al., 2002 )。将称好的土倒入水盆中，加水搅匀，静置 1 min 。将水倒入 一组网筛，即上层为 60 目，下层为 400 目，边倒边震荡分样筛，防止水 充满下层的 400 目筛而从筛中溢出。然后，再在盆中加入水后混匀，静置 1 min ，倒入网筛中，如此重复三次。将 400 目的分样筛取下，用喷头把 400 目网筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入烧杯中，静置。 蔗糖梯度离心将静置烧杯中的上层水轻轻倒掉，只保留下层大约 30 ml 水、线虫和 泥浆的
2、混合物。将混合物轻轻摇匀，倒入离心管中，在天平上调平衡，把 平衡后的离心管放入离心机中，第一次离心(离心机的转速2000 rmin-i，离心时间为4 min )。倒掉第一次离心后的离心管内的上层液，保留土层。 在离心管中分别注入比重为 1.18 gml-i的蔗糖溶液约10 ml，在天平上调平 衡后，摇匀，放入离心机中进行第二次离心。离心后，迅速取出离心管， 把离心管内的上层液倒入 500 目筛中，用水把蔗糖液冲掉，以防线虫在蔗 糖液中脱水变形。然后把线虫液冲入烧杯中，随后再转入试管中。将其静 置 24 h 以上，以使线虫沉淀，并进行饥饿处理，以得到虫体各器官清楚的 线虫标本。 线虫的杀死和固定
3、线虫的杀死采用温和热杀死法( Gentle Heating )。先将水浴锅温度设 定为60C；把静置6 h以上的试管中的上层水小心抽出，只保留大约23ml，线虫集中于试管底部的水中。操作时要避免使试管出现大的晃动，以 免线虫被重新搅起。将抽完水后的试管放入水浴锅中，加热 3 min 杀死线 虫，取出，稍静置冷却，加入等量的 2倍TAF固定液，摇匀，倒入青霉素 小瓶中，写好标签和序号，放入标本盒中(刘维治 , 2000；张万民, 2002) 线虫的科属鉴定在解剖镜下观察计数，然后依据测得的土壤水分将土壤线虫种群折算成 100 g 干土中含有的线虫条数。随机抽取 100 条线虫(不足 100 条的处理全量鉴定，结果折算为 100 条后进行比较)在光学显微镜下进行科属鉴定。根据线虫的取食习性和食 道特征可将其划分为四个营养类群：食细菌线虫、食真菌线虫、植物寄生 线虫和捕食 -杂食线虫( Yeates et al., 1993 )。线虫的分离鉴定参照尹文英 等(1998 )土壤动物分类检索和 Bongers (1988)的De Nematoden van Nederland。
土壤线虫提取、分离与鉴定
