分析方法验证与确认管理规程

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1、3 定义3.1 检验方法验证：证明采用的方法适用于相应检测要求。3.2 检验方法确认：证明使用法定方法在目前实验室条件下是否能获得可靠结果，是否 适用于相应的检测工作。在本质上和验证一样，但不一定是验证项目的全部。3.3 药典方法：经过国家药监部门批准的药典收载的质量标准和检验方法3.4 法定方法：法定方法包括药典方法、国标方法等。3.5 准确度：是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率表 示。3.6 精密度：是指在规定的测试条件下同一个均匀供试品经多次取样测定所得结果之间 的接近程度。3.7 重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。3.8

2、中间精密度：在同一个试验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间 的精密度称为中间精密度。3.9 重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度称为重现性。3.10 专属性：是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方 法能正确测定出被测物质的特性。3.11 检测限：是指供试品中被测物能被检出的最低量。3.12 定量限：是指供试品中被测物能被定量测定的最低量。3.13 线性：是指在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接成正比关系的程度。3.14 范围：是指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低浓度或量的 区间。3.15 耐用性：是指在测定条件有

3、小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。4 职责4.1 标准验证岗4.1.1 提升现行质量标准工作时，对研究后确定的标准草案进行检验方法验证工作，以 确保检验方法的适用性、科学性。4.1.2 对技术部移交的新品质量标准草案进行确认，以确保检验方法适用性、科学性。4.1.3 对技术部移交的新品应研究建立设备清洁验证残留物检验方法，并进行方法学验 证。4.2 理化检验岗4.2.1 对首次采用的药典或国标检验方法，进行检验方法确认工作，以证明检验方法的 适用性，确保检验数据准确、可靠。4.2.2 对标准验证岗研究后确定的质量标准草案中变更后的检验方法进行确认。4.3 微生物岗4.3.1 凡有国家检测

4、机构对成品或中间体微生物限度检验方法进行确认过的，则该方法 可直接用于检验，否则需要按照药典附录要求进行方法学验证。4.3.2 建立产品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控 制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于细菌、霉菌及酵母菌数和控制菌的测 定。5 规程内容5.1 检验方法验证的基本原则 用于检验的分析方法符合下列情形之一但不限于以下情况的，应当对检验方法进行 验证：5.1.1 新建的检验方法，包括新建的产品检验方法和设备清洁验证残留物检验方法等。5.1.2 检验方法需变更的。5.1.3 采用中华人民共和国药典及其他法定标准未收载的检验方法。5.1.4 法规

5、规定的其他需要验证的检验方法。5.1.5 将法定方法用于测定新药，或将某一品种的法定测定方法用于另一品种。5.1.6 检验用设备主要部分改变。5.1.7 药物生产工艺变更、制剂的组分变更。5.1.8 检验条件发生改变可能影响到检验结果时，方法应重新验证。5.2 需要验证的分析项目有：5.2.1 理化检验方法：鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、原料药或制剂中有效成分 含量测定，以及制剂中其他成分（如防腐剂等）的测定。药品溶出度、释放度等检查中， 其溶出量等的测试方法也应做必要的验证。5.2.2 微生物检验方法：细菌、霉菌和酵母菌的定量检查，控制菌的定性检查。5.3 检验方法验证内容有：5.3.1

6、 理化检验方法：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）专属性、 检测限、定量限、线性、范围和耐用性。视具体方法拟定方案。5.2 项下列出的分析项 目和相应的验证内容可供参考。5.3.2 微生物限度检验方法：微生物限度检验方法：细菌、霉菌和酵母菌数的计数方法 验证（菌液回收率），控制菌的专属性的验证。5.4 检验方法应有详细说明，并提供足够的信息，能使经过正确培训的检验人员可靠的 进行检验。5.4.1 理化检验方法要说明的内容至少应包括检测条件（如色谱检测器）、所需试剂、 对照品、结果计算的公式和系统适用性试验。5.4.2 微生物检验方法要说明的内容至少应包括使用的菌种、菌液含量、所需

7、培养基、 培养温度、培养时间、计数方法、结果计算的公式。5.5 检验方法验证应该依据验证方案执行。方案应该包括所有项目的检测方法和接受标 准。验证结果应如实填写，准确完整记录在验证报告中。5.6 理化检验方法验证的分析项目项目内容鉴别限量检查含量测定及溶出量测定定量限度准确性+重复性+中间精密度+重现性+专属性+检测限+定量限+线性+范围+耐用性+注：已有重现性验证，不需要验证中间精密度。 重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。 如有一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。以上表中列举了在不同类型的分析方法验证中被认为是最重要的项目，“”表示 通常不需要验证的项目，“+”表示通常需要

8、验证的项目，如遇特殊情况，仍应根据具体 分析对象和情况而定。5.7 检验方法确认的基本原则5.7.1 法定方法中的鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、原料药或制剂中有效成分含 量测定需要酌情考虑进行方法确认，其余方法不需要进行确认。5.7.2 从一个实验室到另一个实验室的检验方法转移，可采用对照试验法，即取同一批 样品，按此法在两实验室分别进行实验，将结果进行比较。5.7.3 检验方法确认内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）专 属性、定量限。视具体方法拟定方案。5.8 项下列出的分析项目和相应的确认内容可供5.7.4 检验方法确认应依据确认方案执行。方案应该包括所有项目的检测

9、方法和接受标 准。确认结果应如实填写，准确完整记录在确认报告中。5.8 理化检验方法确认的分析项目原料药理化检验方法确认的项目项目鉴别有关物质检杳含量测定滴定法HPLC准确度精密度视情况而定视情况而定视情况而定专属性视情况而定+视情况而定检测限定量限+制剂理化检验方法确认的项目项目内容、鉴别检杳（不溶性微粒检杳、 含量均匀度、溶出度检 查）杂质（有关物质、残留溶剂）含量测定准确度视情况而定视情况而定视情况而定精密度+专属性+检测限定量限视情况而定+注：以上表中列举了在不同类型的检验方法确认中被认为是最重要的项目，“”表示 通常不需要确认的项目；“+”表示通常需要确认的项目；如遇特殊情况，仍应根

10、据具体 分析对象和情况而定。5.9理化检验方法验证各分析项目的内容描述5.9.1准确度： 用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。准确度一般用回收率表示，应在规定的范围内测试。5.9.1.1可用已知纯度的做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再加入一 定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实际值与供试品中含有量之差，除以 加入对照品量计算回收率。C-A回收率 =x 100%B公式中：A表示供试品所含被测成分量，一般是采用重复性结果的均值。B表示加入对照品量C表示实测值5.9.1.2数据要求：a）在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价，加入的的量 与所取供试品含量

11、之比控制在1：1左右；b）或设计3不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测 定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1：1左右。 5.9.1.3记录结果：应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%） 计算值，以及回收率（%）的相对平均偏差（RSD%）。5.9.2精密度：5.9.2.1精密度包括重复性、中间精密度和重现性。一般用偏差、标准偏差或相对标准 偏差来表示。5.9.2.2重复性：在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价；或 者设计3不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定,用9个测定结果进 行评

12、价。5.9.2.3中间精密度：是同一实验室的变化（通常是不同日期，不同分析人员、不同的 设备等），测定结果之间的精密度。如果进行重现性评价，中间精密度就不需要了。5.9.2.4 重现性：不同实验室、不同分析人员检验相同产品的结果应平行，样品批数至 少是 3 批。5.9.3 专属性：5.9.3.1 应该在鉴别试验，限度检查、含量测定等方法均应考察其专属性。5.9.3.2 鉴别试验：以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含待测成分的 模拟方），不得干扰测定，以说明方法的专属性。应附加相应的代表性图像或图谱。5.9.3.3 含量测定和限量检查：以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含

13、 待测成分的模拟方），不得干扰测定，以说明方法的专属性。色谱法、光谱法等应附代 表性图谱，并表明相关成分在图中的位置，色谱中的分离度应符合要求。必要时可采用 二极管阵列检测和质谱检测，进行峰纯度检查。5.9.4 检测限：确定检测限的常用方法如下：5.9.4.1 直观法：用一系列已知浓度的供试品进行分析，试验出能被可靠的检测的最低 浓度或量。5.9.4.2 信噪比法：仅适用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度供试品的信 号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信 噪比为 3：1 或 2：1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。3 3n根据响应值的标准差和斜率

14、：检测限度DL = 竺S其中S：校正曲线的斜率，S值是被分析物的校正曲线的斜率。o：响应值的标准差，o值可根据空白的标准差：通过分析 11 份空白样品的分析，测出分析背景响应值的大小，然后计算这些响应值的标准偏差。5.9.4.3 数据要求：应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。5.9.5 定量限：确定检测限的常用方法如下：5.9.5.1 信噪比法：仅适用于能显示基线噪音的分析方法。一般以信噪比为10：1 时相 应浓度或注入仪器的量确定定量限。根据响应值的标准差和斜率：定量限度QL =S：校正曲线的斜率5 :响应值的标准差S 值是被分析物的校正曲线的斜率。5 值可根据空白的标准差:通过分析 1

15、1 份空白样品的分析，测出分析背景响 应值的大小，然后计算这些响应值的标准偏差。5.9.5.2 数据要求:应附测试图谱，说明测试过程和定量限结果。5.9.6 线性:5.9.6.1 可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试品的方法进行测 定，至少制备 6 个浓度的供试品。5.9.6.2 以测得的相应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二 乘法进行线性回归。数据要求:应列出回归方程、相关系数和线性图。5.9.7 范围: 应依据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。无特殊要求 时，通常采用以下标准。5.9.7.1原料药和制剂的含量测定，范围应为测试浓

16、度的80%120%。5.9.7.2制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度70%130%，根据剂型特点，如气雾 剂和喷雾剂，范围可适当放宽。5.9.7.3 溶出度应为测试或释放度的溶出量测定，范围应为限度的 20%；如果规定了 限度范围，则应为下限的20%至上限的+20%。5.9.7.4 如果含量测定与杂质检查同时测定，用面积归一化法，则线性范围应为杂质规 定限度的20%至含量限度（或上限）的+20%。5.9.7.5 杂质测定，范围应根据初步实测，拟定出规定的限度的+20%。5.9.7.6 对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于限定含量的区间。5.9.8 耐用性: 试验说明小的变动能

17、否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。如果测试条 件要求苛刻，则应在方法中写明。5.9.8.1 液相色谱法中变动因素有:被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间，流动相 的组成比例或 pH 值，不同厂牌或批号的同类型色谱柱，柱温，流速及检测波长等。5.9.8.2 气相色谱法变动因素有:被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间，不同厂牌 或批号的同类型色谱柱，柱温，固定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度5.9.8.3薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层展开时温度及相 对湿度等。5.10 微生物检验方法验证的内容 计数方法的验证：细菌、霉菌和酵母菌的定量检测5.10.1

18、各试验组制备方法：5.10.1.1试验组：a）平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液lml和50lOOcfu试验菌， 按平皿法测定其菌数。b）薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗， 在最后一次的冲洗液中加入50lOOcfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 5.10.1.2菌液组：测定所加的试验菌数，菌液含量在50lOOcfu。5.10.1.3 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数，供 试品对照组含菌量不能超过10 cfu/ml。5.10.1.4 稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特 殊处理时，应增

19、加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验 时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每lml供试液含50 lOOcfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。5.10.2 计数方法检测：计数方法包括平皿法、薄膜过滤法、培养基稀释法及中和法。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。菌液回收率%=试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数菌液组平均菌落数x 100%5.1O.3 结果判断：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照 组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试

20、验组的菌回收 率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的 百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母 菌数，验证通过；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、 离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性， 并重新进行方法验证。5.10.4 报告：供试品制备方法、菌液组平均菌落数、供试品中菌液加入量、试验组的 平均菌落数、供试品对照组平均菌落数、测定结果和菌液回收率（%）计。5.11 控制菌检查方法的验证：5.11.1 依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验

21、证的菌株。验证 大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。5.11.2 验证方法：5.11.2.1取规定量供试液及10lOOcfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查 法进行下一步生化反应等检查。5.11.2.2 当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一 次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中，依相应控制菌检 查法进行下一步生化反应等检查。5.11.2.3 验证中设阴性对照和阳性对照。5.11.3 结果判断：若上述验证方法中的试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌 检查法进行供试品的该控制菌检查，阴性对照为阴性，阳性对照为阳性，供试品

22、试验组 为阳性，表明验证通过；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌 法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进 行方法验证。5.11.4 报告：供试液制备方法、加入的菌液含量、生化反应、阴性对照、阳性对照、 供试品试验组的检测结果。5.12 检验方法验证与确认工作流程5.12.1 验证方案起草验证负责人负责起草方案或者组织起草方案，并依据公司验证模板起草制定检验方 法验证/确认方案，包括目的、范围、内容、特别说明、人员职责、合格标准等内容。5.12.2 验证方案审批方案经过小组成员讨论确认后，提交给验证负责人签字确认后，再提交给验证负责 部门

23、及相关部门经理审批，验证/确认方案最终经质量总监或 QA 负责人批准后方能生效。5.12.3 验证方案实施验证小组负责人负责验证/确认的组织工作，包括实施验证/确认，收集记录、整理 数据、出具报告和结论等工作的实施。5.12.4 验证报告的整理小组成员在实施验证/确认的工作中，准确及时填写报告，包括收集图谱、整理数 据、出具报告结论等工作。5.12.5 报告的审批 验证报告的结论经小组负责成员签字确认后，提交给验证负责人签字确认后，再交 给验证负责部门及相关部门经理审核，验证/确认报告最终经质量总监或 QA 负责人批准 后方能生效。5.12.6 方案及报告资料交 QA 归档验证/确认方案和报告经质量总监或QA负责人批准后交QA归档统一保管。