藜芦生物碱引起小鼠脑细胞DNA损伤的构毒关系研究-中药学

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1、I摘 要目的：藜芦为百合科藜芦属植物。 南方主要有毒植物记载，藜芦根茎叶花均可以引起中毒，地下部分的根茎部毒性为最高。导致中毒的症状为：腹部热痛，流涎，呕吐，恶心，腹泻，出汗，虚弱，丧失意识；严重中毒出现脉率异常，大便出血，浑身抽搐，昏迷，最后因停止呼吸而致死。藜芦生物碱是藜芦的主要活性成分，同时又是毒性成分。藜芦生物碱具有显著降压和抗肿瘤等活性，其毒性主要是对神经系统和胚胎有影响。表现为引起神经系统的钠离子通道和钙离子通道持续放电，以及导致多种实验动物致畸现象。由于前期发现藜芦生物碱可引起小鼠脑神经 DNA 损伤，结构特征不同，损伤程度也有差异。所以，本课题以藜芦生物碱为研究对象，探讨藜芦生

2、物碱不同结构特征的单体成分对小鼠脑细胞 DNA 损伤的影响，建立构毒关系，以期为藜芦进一步的毒理研究提供理论依据。方法：细胞 DNA 损伤与修复、DNA 交联、放射生物学及遗传毒理等领域的研究，广泛用彗星实验（单细胞凝胶电泳实验）在单细胞水平上检测 DNA 损伤。本实验采用彗星实验的方法检测 19 种不同结构特征的藜芦生物碱对小鼠小脑和大脑皮层脑细胞DNA 损伤作用，并且分为不同剂量组给药，通过实验数据来比较其损伤程度，探讨藜芦生物碱引起小鼠脑细胞 DNA 损伤的结构与毒性的关系。结果：用 CASP 软件对彗星实验所得的细胞 DNA 损伤图分析，对数值进行汇总得出：母核结构为西藜芦碱类和介藜芦

3、胺类，对 DNA 损伤基本强于母核结构为维藜芦碱类、番茄立定碱类；介藜芦胺类结构中 D 环为苯环结构的藜芦胺（ Veratramine）引起DNA 损伤显著，藜芦胺结构 3 位葡萄糖苷化的藜芦新碱（Veratrosine）引起 DNA 损伤较显著；西藜芦碱类结构中有 12 位羟基取代的 12-羟基藜芦酰棋盘花碱（12-hydroxylveratroylzygadenine）引起 DNA 损伤显著。结论：藜芦生物碱对小鼠小脑和大脑皮层细胞 DNA 均有不同程度的损伤作用；大II部分呈剂量依赖性。不同母核特征的藜芦生物碱对小鼠小脑和大脑皮层细胞 DNA 损伤程度有差异，并且同一母核特征的生物碱所连

4、的取代基团结构对损伤程度也有直接的关联性，为后期深入探讨其致毒机理提供理论依据。关键词：藜芦生物碱，彗星实验，DNA 损伤，构毒关系IIIABSTRACTObjective: Liliaceae Veratrum plant.South“Poisonous Plants”records,quinoa phragmites flower stems can be caused by poisoning,toxic roots underground part of the Ministry of the highest.Lead poisoning symptoms are:abdominal

5、pain,fever,salivation,vomiting,nausea,diarrhea,sweating,weakness,loss of consciousness;severe poisoning appear abnormal pulse rate,bowel bleeding,covered with convulsions,coma,and finally stopped breathing due to death.Alkaloids is the main active ingredient hellebore,but it is also toxic ingredient

6、s.Alkaloids have significant antihypertensive and anti-tumor activity,its toxicity primarily affects the nervous system and the embryo.Performance of the nervous system caused by sodium ion channels and calcium channels continuous discharge,and causes avariety of experimental animals Teratogenicity

7、phenomena.Since the early discovery,alkaloids can cause DNA damage in mouse brain,different structural characteristics,there are differences in the degree of injury.Therefore,subject to the alkaloids for the study,investigate the effect of alkaloids different structural characteristics of monomer co

8、mponents of DNA damage in mouse brain cells to build structures poison relations,with a view to further toxicological studies provided hellebore theory.Methods: The study of DNA damage and repair,DNA crosslinking, radiation biology and genetic toxicology and other areas,widely used comet assay (sing

9、le cell gel electrophoresis) to detect DNA damage at the single cell level.The experiment using comet assay was used to detect 19 different structural characteristics of alkaloids mouse cerebellum and cerebral cortex of DNA damage in brain cells,and is divided into different dose group,to compare th

10、e extent of damage to the experimental data,explore alkaloids cause DNA damage in mouse brain cells relationship between structure and toxicity.Results: CASP software for cells DNA damage resulting figure comet assay analysis,summarize numerical results:core structure for the West hellebore hellebor

11、e referral bases and amines,DNA damage in the nucleus of a strong basic structure for peacekeeping hellebore bases,tomato standing bases;referral hellebore D amine structure veratramine benzene ring structure caused significant DNA damage,veratramine 3 glucoside structure of veratrosine induced DNA

12、damage more significaIVnt;West Veratrum alkaloids structure has 12 hydroxyl-substituted 12-hydroxy acid checkerboard hellebore flower base (12-hydroxylveratroylzygadenine) induced DNA damage is significant.Conclusion: alkaloids on mouse cerebellum and cerebral cortex cells have DNA damage of varying

13、 degrees;most dose-dependent manner.Different characteristics of the nucleus are different alkaloids and extent of the cerebellar cortex cell DNA damage in mice,and features the same nucleus of alkaloids substituents attached structure on the extent of damage also has direct relevance for post depth

14、 To investigate the mechanism of its toxicity to provide a theoretical basis.Keywords: veratridine,comet assay,DNA damage,Structure poison relationshipV目 录摘 要 .IABSTRACT .III第一章 前言.1一 藜芦介绍 .111 藜芦化学成分研究进展.112 藜芦药理研究进展.313 藜芦毒性和毒理研究.614 藜芦生物碱的代谢研究.815 藜芦的中药配伍研究进展.916 藜芦的构毒关系研究.1017 本节小结.11二 单细胞凝胶电泳实验

15、介绍 .1121 DNA 损伤、检测方法 .1122 SCGE 实验发展简介 .1223 SCGE 实验方法 .1324 SCGE 实验的应用 .17三 选题依据和研究意义 .18第二章 藜芦生物碱引起小鼠脑细胞 DNA 损伤的构毒关系研究 .21一 实验材料 .2111 实验动物.2112 试剂与药品.2113 实验仪器.2314 分析软件.24二 实验方法 .2421 试剂的配制.24VI22 样品给药.2423 细胞混悬液的制备.2424 玻片的制备.2425 细胞的裂解.2526 DNA 的碱解旋 .2527 电泳.2528 中和、固定.2529 染色、阅片.26210 统计分析.26

16、三 实验结果 .2631 实验方法的建立.2632 实验结果数据及作图.27四 结论和讨论 .3541 不同藜芦碱引起小鼠脑部 DNA 损伤 .3542 SCGE 实验方法简议 .36第三章 全文总结.39参考文献.41攻读学位期间发表的学术论文目录.51致 谢.53第一章 前言1第一章 前言一 藜芦介绍百合科植物藜芦，全世界大概有 40 种，分布在欧洲、北美和亚洲， 中国植物志整理记载，在我国藜芦属植物大约 24 种，其中发现有药用植物的有 13 个种和 1 个变种。在上世纪末期，四川、云南地区出现 2 个新品种有： 贡山藜芦和南川藜芦 1；发现于秦岭的有一个变种：总状藜芦 2。藜芦属植物在

17、我国境内分布以云、川地区分布最多，东北、东南、中原地区也有分布。常用的药用植物有：藜芦、蒙自藜芦、兴安藜芦、狭叶藜芦、尖被藜芦等 3。藜芦味辛，苦，性寒，有大毒，归胃，肝，肺经。中国传统医学里藜芦用药早在神农本草经就有记载，用药部位在根部和根茎部分。藜芦对中风病痰，喉梗阻，癫痫和恶性疮，头痛，黄疸等有治疗效果 4。11 藜芦化学成分研究进展我国学者研究中药藜芦多年，目前发现其含有以下几类化学成分：111 生物碱类我国研究者对藜芦属植物中的生物碱类成分做了深入调查和研究，在不同品种的藜芦中发现了诸多甾体生物碱成分，种类丰富，目前发现的藜芦生物碱有 100 多种。按其生物碱的基本骨架可以分为两类：

18、异甾生物碱类和胆甾生物碱类。前者又可进一步细分有西藜芦碱类和介藜芦碱类；后者又可进一步细分为茄次碱类，维藜芦碱类和新类型碱类 5。具体的生物碱单体有藜芦 6-8中的介芬胺，藜芦明，藜芦马林碱，原藜芦碱，伪介芬胺，藜芦嗪，红介芬胺，3-当归酰基计明碱、3-双羟基异戊酰基-15-异戊酰基计明碱，3-藜芦酰基计明喊，3- 藜芦酰基棋盘花胺，7-乙酰-15-异戊酰基-3- 藜芦酰基计明碱等。长梗藜芦 9中的 3-当归酰棋盘花胺， 绿藜芦碱等。天目藜芦 10-12中的天目藜芦胺A、B；异红介藜芦碱、藜芦托素等。蒙自藜芦 13中有藜芦胺-N- 氧化物，藜芦明宁，藜芦生物碱引起小鼠脑细胞 DNA 损伤的构毒

19、关系研究23，15- 二当归酰基计明碱等。乌苏里藜芦 14-17里有介芬胺，新计巴丁，哥美任，计巴丁，15-O-(2-甲基丁酰)计明碱，藜芦嗪，棋盘花胺，6-羟基-7-甲氧基-2-(3-羟基-2 ，5-二甲氧基苯基) 苯骈呋喃，白藜芦醇等。尖被藜芦 18-20 里有棋盘花内酯，玉红介芬胺，藜芦胺，20-异藜芦胺，介芬胺，23-O-吡喃葡萄糖-20-异藜芦胺，23-O-吡喃葡萄糖-5，11 ，13- 藜芦三烯碱 -3-23- 二醇等。毛叶藜芦 18里有棋盘花辛，参农美宁，大花藜芦嗪，茄定二烯二醇，棋盘花内酯，绿藜芦碱，藜芦烯酮，异特因明，哈枯绕定，原西藜芦碱、11去氧介芬胺等。毛穗藜芦 21-2

20、3里有哥满春，藜芦嗪宁，毛穗藜芦碱，棋盘花胺，3-当归酰棋盘花胺异藜芦嗪等。黑紫藜芦 2425 里有：3-当归酰棋盘花胺，正二十八烷醇、B-谷甾醇、表红介藜芦碱等。狭叶藜芦 26里有介芬胺，1-查茄碱，棋盘花胺，茄定二烯二醇，3-藜芦酰棋盘花胺，狭叶藜芦碱 A、B、C 、D 等。阿尔泰藜芦 18里有：原藜芦碱 A，3-乙酰基-15- 藜芦酰计明碱)，15-藜芦酰计明碱，计巴丁，7-去乙酰原藜芦碱 A，6，7-双去乙酰原藜芦碱 A，哥美任 -茄碱，藜芦立宁，藜芦洛明等。另有人从欧洲白藜芦中分得出生物碱有：5 种介藜芦碱类，2 种西藜芦碱类异甾生物碱和 1 种藜芦胺类。从美国产绿藜芦分得到 25

21、种甾体生物碱，2 种维藜芦生物碱和 4 种茄类生物碱。112 黄酮类王斌等 27对藜芦的化学成分进行研究，分离有异鼠李素，5，7，4-三羟基-3-甲氧基黄酮，异槲皮苷，5，7，3 ，5-四羟基黄酮，5，7，3 ，4-四羟基黄酮。Li HL 等 28从藜芦中分离出两个黄酮苷类化合物，分别是 4-methoxyl-glucotricin 和 3，4-dimethoxyl-quercitrin 。113 二肽类赵伟杰等 29，30 研究乌苏里藜芦，从其根茎中提取出了刺孢麴霉碱和橙黄胡椒酰胺为二肽类成分。114 茋类赵伟杰 31从藜芦根茎中分出 2，3 ，4，5一四羟基茋，白藜芦醇和verussust

22、ilbene。毛穗藜芦中也分得有 2，3 ，4，5-四羟基茋和白藜芦醇 32，从台湾产的黑紫藜芦分得有反式白藜芦醇 33。第一章 前言3115 其他杨崇仁等 34从蒙自藜芦分得胡萝卜苷，- 谷甾醇蜡酸和硬脂酸；梁广义等 26从狭叶藜芦分得木蜡酸，-谷甾醇和硬脂酸；刘冰等 8对藜芦进行研究分析，分离有：2，3 一甲氧基环杷明，15 异戊酰基-3-藜芦酰基原藜芦碱；全香花等 35从兴安藜芦分得胡萝卜苷和 - 谷甾醇；目前，国内学者研究东北产的藜芦，分离得到藜芦胺和介芬碱，并且发现此藜芦植物中有环杷明（环巴胺，11-去氧芥芬胺，Cyclopamine）的存在 36。12 藜芦药理研究进展从藜芦的根、

23、茎、叶分离出的多种单体成分，研究其对小鼠的急性毒性成分，由LD50 进行分析判定了西藜芦碱类引起小鼠中毒比较严重，其是藜芦中主要的毒性成分37。藜芦中主要的药理活性成分是生物碱成分，与此同时其也是藜芦产生毒性的主要作用部分，一直是学者们研究的要点。其药理作用有：121 降低血压作用藜芦的药理作用中，降低血压的作用是最早的被研究出的作用。20 世纪中期就有藜芦降低血压的报道，藜芦生物碱种类不同，降压效果有很大区别 38。蒙自藜芦给麻醉猫静脉给药 0.1g/kg 后血压立即下降，最低降压率是 52-72%，降压持续时间 1-2h 以上，反复给药无快速耐受现象，降血压作用机理主要是作用点在于颈动脉窦

24、和反射性使心肺感受区受到影响引起血压降低 39。光脉藜芦中的生物碱降低血压作用强而快，剂量增大则降压效果越明显。其能明显降低猫的后肢血管灌注压，说明其对血管有直接的扩张作用。其降压作用与 、 和 M 受体无关，也与组胺的释放无关 40。狭叶藜芦碱甲降低血压作用速度快，与其存在扩张脑血管的作用有关 41。汤建等 42研究对 RHR 大鼠的降低血压作用，大鼠脑内（RHR ）的儿茶酚氨 (CA)能神经元的活性有增强作用。黑藜芦生物碱用两种方法股静脉、椎动脉分别给药都产生良好的降低血压的效果，但两方法的降低血压作用效果几乎相同，提示黑藜芦生物碱是非中枢性的降压药。向舌动脉注射黑藜芦生物碱，瞬膜收缩幅度

25、几乎没有改变，提示黑藜芦生物碱也不阻断交感神经节。其与组胺受体、肾上腺 受体、M 胆碱受体均无关，其确切的作用机制需要深入研究 43。研究证明，黑藜芦生物碱对实验动物 SHR 、肾性高血压鼠及正常猫均可以引起血压减低和降低心率的效果 44。王清等 45研究新型降压药藜芦胺的降压作用，经正常状态下的猫、大鼠的十二指藜芦生物碱引起小鼠脑细胞 DNA 损伤的构毒关系研究4肠给药，藜芦胺可以显著降低血压，使大鼠和猫的心率变慢，剂量越大随之降压作用越强。由此推断出其是藜芦总生物碱使血压下降的一个重要有效部分。赵瑜等 46考察藜芦中含量较多的原藜芦碱 A（PA）作用于大鼠呼吸系统，心血管系统，得出了随 P

26、A浓度增大可以使大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压相应地下降。可以降低呼吸频率、升高呼吸幅度，并且之间存在量-效关系。122 对心脏的作用狭叶藜芦碱甲可用于治疗高血压心衰，可以降低心脏的前后负荷，能抑制心肌的兴奋性传导，明显降低心肌耗氧和做功，利于缓解心脏的过度负荷，减慢心律，在实验剂量合适范围内，不影响心脏的正常泵血功能。与此同时对其他脏器需血量不产生影响 41。但如果过量则会引起窦性心律变慢产生毒性作用 68。藜芦混碱是藜芦中几种生物碱混合在一起，未经纯化分离的，以藜芦定为主成分，藜芦碱作用于中枢神经，引起大脑产生兴奋出现痉挛，抽搐，而后大脑出现抑制产生昏迷等意识方面障碍。其已被证实具有使心肌

27、收缩力增强、钠通道开放的时长增加，以藜芦混碱促进钠通道开放作用于大鼠的离体心脏，进行灌流，发现在浓度低于 40.0 mg/L，高于 4mg/L 时，心律失常现象不明显，但当浓度超过 40.0mg/L，暂时的心动过速会出现 47。123 对神经作用藜芦碱低剂量时存在良好的降压效果，高剂量时神经细胞钙离子含量增多，导致神经兴奋，心律失常，细胞膜去极化，增强膜的兴奋性。尼莫地平能降低这种由藜芦碱引起的细胞内部的钙离子含量升高现象，并有效地拮抗钠钙交换增多，从而防止神经细胞免受损伤。有报道 48称，当藜芦碱浓度在 l.5-5.0mol/kg 可抑制钠通道失活。藜芦碱会引起大鼠感觉神经元部发生触发性振荡 49。使大鼠的坐骨神经受到损伤，把藜芦碱提取液浓度在 5mol/L，作用于前者，显示出如山峰状的放电情况，提示作用机理是藜芦碱抑制了钠离子通道的失活，导致钠内流速度变慢 50。藜芦碱溶液在低剂量时可改变大鼠脑区海马的锥体神经元放电的模式，引发慢波癫痫样电活动，并且抑制突触传递的成分不影响这种癫痫样放电的产生，但此放电的产生可以被 TTX 河豚毒素所抑制，它可以阻断连续性的钠内流，从而使钠钙交换减少，抑制癫痫的发生 51。124 抗血栓作用