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1、二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（）和发根农杆菌（m根癌农杆菌含有质粒。发根农杆菌含有质粒。根癌农杆菌的质粒和发根农杆菌质粒都具有一段转移n又称，在农杆菌侵染植物时，可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于能够进行高频率的转移，而且质粒和质粒上可插入大到甚至的外源基因，因此，质粒和质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和质粒上以外区的基因。染色体基因包括、以及。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着
2、于植物受伤细胞上。蛋白可能在低和磷酸饥饿情况下提高蛋白的合成水平。与蛋白共同对起激活作用。原始的质粒根据其功能的不同，可分为个区：（）区：是在农杆菌侵染细胞时，从质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与本身的转移与整合无关。上最重要的是两端的个边界和，它们是转移所必需的。只要其存在，可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，的右边界在的整合中对于靶位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要.（）毒性区：位于以外的个的区域内，该区段编码的基因但对的转移和整合非常重要.这些基因也称为质粒编码毒性基因。（）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因
3、，调控质粒在农杆菌间转移。（）复制起始区：该区段调控质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包、以及、它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子对于农杆菌的生长非常重要，但非必需高水平的糖结合蛋白一可以扩大蛋白对酚类物质的识别范围。结合盒式转运体类似物蛋白，参与区基因的表达调控，基因座中插入无启动子的，农杆菌侵染力以及区基因表达量大大下降，突变体中组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明通过影响表达控制毒性。2 Vir基因的诱导表达机制在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号酚类化合物
4、，如乙酰丁香酮。当农杆菌接受到此类信号时，其区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，和单糖可协同诱导质粒上区基因的表达。区基因的活化首先是从基因开始的。蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使蛋白活化。蛋白是结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到启动子的特定区域，从而成为其它基因转录的激活因子，打开、等几个基因。可大大增强基因被诱导的效果，可结合一些单糖，也可直接与周质区相互作用，以加强对基因的诱导。3 T-DNA复合物的形成的加工与转移是由基因被诱导后产
5、生的蛋白完成。基因编码的两个产物和直接参与加工过程。蛋白是一种拓扑异构酶,可将超螺旋型变成松弛型。蛋白具有特异剪切单链的内切酶活性，它可以识别底链边界重复序列上的特定位点，并在底链重复序列和第四个碱基之间切割，将从质粒上剪切下来，称为或链。切开后，蛋白与链的，端共价结合，避免核酸外切酶降解链。新的底链以此链为模板，从右端产生的缺口处以3方向进行合成。被取代的旧链游离出来，与许多蛋白分子结合组成复合体。此外，作为一个导向蛋白，可以指导整个复合体（或叫复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。4 T-DNA复合物的跨膜转运农杆菌的转移通道由多达种蛋白组成，包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合
6、体。该通道也可称为复合体运输器，由编码的种蛋白和蛋白组成。可在细菌膜上为复合体运输器的装备提供位点；和可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的、为复合体的运输提供能量。合成的复合体经过复合体运输器，以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内，并在和的核定位信号（）序列引导下，以为先导向植物细胞核运动。在人工构建的质粒中，基因和可以放在同一个质粒上，也可以放在不同的质粒上。动影响转化效率的因素动1、菌株染色体背景动不同农杆菌株的类型的基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操
7、作，但共培养时菌体附着后不易洗去。2、共培养方式农杆菌转化的共培养介质可以是细菌培养基或植物受体培养基。烟草等对农杆菌侵染比较敏感的植物的共培养时间一般较短，液体细菌培养基介质应用较多。许多单子叶植物等不敏感植物受体与农杆菌共培养时间一般较长，用细菌培养介质容易造成农杆菌过度繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害，因此多采用液体植物培养基作为共培养介质。3、侵染浓度和时间农杆菌适宜的侵染浓度和时间因外植体对侵染的敏感性不同而有很大差异。浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。禾谷类作物
8、一般侵染浓度较高，用转化水稻的最佳接种浓度为0用转化玉米幼胚采用的侵染浓度为；但烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多一般为=4、共培养条件()共培养温度农杆菌在C的范围内都可以生长，不同研究结果中区基因表达的适宜温度有一定差异，但多数在C获得较高的表达水平外植体生长温度也一般在此范围内，所以通常选取外植体的最佳生长温度为共培养温度，通常在C左右。()共培养值研究人员普遍认为酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。因为植物细胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质(如酚类、糖类)虽然在不同酸碱度下比较稳定，但在时对基因的诱导能力最高。()诱导物和抑制物酚类是区基因表达的主要信号物质。酚类
9、物质产量低一度被认为是影响农杆菌转化，特别是单子叶植物转化的主要原因之一。在众多的酚类物质中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮诱导能力较强，的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的值有关。没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、儿茶酚、对羟基苯酚等多酚混合处理农杆菌也有很高的作用，但不同酚类物质是否有累加效应在不同研究结果中不近相同。不同农杆菌类型对酚类物质的敏感性不同，根癌农杆菌的章鱼碱株系比胭脂碱系需要更高的酚类物质诱导，发根农杆菌的农杆碱型比甘露碱型对酚类物质刺激的敏感性更低。糖类等小分子,这些小分子一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动,另一方面可诱导或抑制农杆菌基因的表达。而糖类的主要作
10、用是与农杆菌染色体毒性蛋白结合激活蛋白进而诱导基因高水平表达和扩大农杆菌的寄主范围。特别在浓度很低的情况下它们可强烈诱导基因的表达并且与存在协同效应可显著提高诱导效果。糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显但是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。等曾用多胺物质对农杆菌进行活化后侵染烟草做瞬时表达研究结果表明农杆菌的侵染活力显著提高。（4）共培养时激素的添加、有无光照共培养培养基中添加生长素、细胞分裂素对转化更有利。而光照的有无要是植物种类而异。5、受体类型和生理状态不同基因型对农杆菌侵染敏感性有差异。目前用过的受体材料有叶盘、叶柄、根尖根段、
11、茎尖茎段、幼穗、花药、子叶（柄）、胚或其部分结构（胚轴）、芽等，可以看出分生组织是较通用的受体。分生能力强的植物细胞对农杆菌敏感，活跃的细胞分裂促进了的整合。6、预培养培养基外植体进行共培养前,在含有外源激素的培养基上预培养一段时间,使植物组织代谢活跃促进细胞分裂分裂状态的细胞更易整合外源从而提高外源基因的瞬时表达和转化率。有人认为,在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。钙在对致病微生物抵抗方面起到重要作用而而钙的不足会引起细胞壁结构的改变而这种改变使农杆菌更容易附在愈伤上增强农杆菌对愈伤的感染能力。7、接种方式比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡而时间长短视菌种和外植体种类而异。
12、有的研究者在浸泡的基础上结合了振荡进行接种振，荡培养能打破细胞表面的气泡而使农杆菌与外植体的接触面增大而有利于农杆菌侵染。近年来而在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术而如超声波辅助农杆菌介导法、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等均可增强农杆菌浸染提高转化效率8、感受态细胞保存条件有实验表明，农杆菌感受态细胞以新鲜制备时效果较好，农杆菌感受态细胞在C保存以内时进行转化可以得到部分转化子，而用甘油保存置于C和C的感受态细胞转化效率较低。不过应该根据自己的试验情况进行优化。另外，植物基因型、靶细胞生理状态及对转化植株的筛选程序、外植体处理、合适的再生筛选体系等因素也会对转化效率产生影响。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
