生物化学与分子生物学：DNA的生物合成

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1、目录目录第十四章第十四章DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )目录目录复制复制(replication) 是以是以DNA为模板的为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。聚合反应。 复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA目录目录n本章主要内容：本章主要内容： DNA DNA复制的基本特征复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化复

2、制的酶学和拓扑学变化 原核生物原核生物DNADNA复制过程复制过程真核生物真核生物DNADNA生物合成过程生物合成过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNA复制的基本特征复制的基本特征Basic Rules of DNA Replication第第 一一 节节目录目录半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) nDNA复制的主要特征复制的主要特征 目录目录一、一、 DNA以半保留方式进行

3、复制以半保留方式进行复制 DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两解开为两股单链，各自作为模板股单链，各自作为模板(template)按碱基配按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。碱基序列一致。这种复制方式称为这种复制方式称为半保留复制半保留复制。n半保留复制半保留复制的概念的概念: :目录目录n子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信

4、息的几种可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度实验密度梯度实验: : 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含含15N-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果目录目录按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。n半保留复制的意义半保留复制的意义: :遗传的保守性，是物种稳定

5、性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。目录目录AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA目录目录 原核生物基因组是环状原核生物基因组是环状DNA，只有一个，只有一个复制起复制起点（点（origin）。复制从起点开始，向两个方向。复制从起点开始，向两个方向进

6、行解链，进行的是单点起始进行解链，进行的是单点起始双向复制双向复制。二、二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制从起点向两个方向延伸复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C目录目录 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个的距离定为一个复制子复制子(replicon) 。复制子是。复制

7、子是独立完成复制的功能单位。独立完成复制的功能单位。 53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制3目录目录三、三、DNA复制反应呈半不连续特征复制反应呈半不连续特征3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)目录目录 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解

8、链方向连续延长，这股不连续复制的能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为链称为后随链后随链(lagging strand) 。复制中的不连。复制中的不连续片段称为续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。制的半不连续性。 目录目录DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化第第 二二 节节The Enzymology and Topology of DNA Replication目录目录n参与参与DNA复制的物质复制的物质: 底物底物(substrate): dA

9、TP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，简写为简写为 DNA-pol； 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合； 其他的其他的酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子。目录目录(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiRNA引物引物RNA引物引物子代子代DNA目录目录n聚合反应的特点聚合反应的特点: : DNA 新链生成需新链生成需RNA引物引物和和模板模板； 新链的延长只可沿

10、新链的延长只可沿5 3 方向进行。方向进行。目录目录一、一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：简称：DNA-pol 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的

11、 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 目录目录（一）原核生物有（一）原核生物有3种种DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不

12、可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I目录目录个核心酶个核心酶1个个 -复合物（复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚种亚基）基）1对对 -亚基（可滑动亚基（可滑动的的DNA夹子）夹子）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构全酶结构包括：全酶结构包括：目录目录 亚基亚基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亚基亚基具有具有35 外切

13、酶活性（复制保真性外切酶活性（复制保真性所必需）所必需） 亚基可增强其活性亚基可增强其活性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用核心酶由核心酶由 、 和和 亚基组成：亚基组成：两侧的两侧的 亚基发挥夹稳亚基发挥夹稳DNADNA模板链，并使酶沿模模板链，并使酶沿模板滑动的作用板滑动的作用目录目录2个个 -亚基亚基分别和分别和1个核心酶相互作用，其个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。前导链和后随链。功能：功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶

14、有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用活性的作用 -复合物由复合物由6种亚基组成：种亚基组成： 、 、 、 、 、 目录目录n功能：功能： DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行

15、分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录目录 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。目录目录（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长

16、子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较聚合酶的比较 E.Coli真核细胞真核细胞 功能功能填补复制中的填补复制中的DNA空隙，空隙，DNA修复和修复和重组重组复制中的校对，复制中的校对，DNA修复修复 DNA修复修复 线粒体线粒体DNA合成合成 前导链合成前导链合成DnaG 引物酶引物酶 后随链合成

17、后随链合成目录目录真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发

18、，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol目录目录二、二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性能实现复制的保真性 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录目录遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱

19、基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。复制出错时有即时校对功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制：复制的保真性至少要依赖三种机制：目录目录（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择 利用利用“错配错配”实验发现，实验发现，DNA pol DNA pol 对核苷酸的对核苷酸的参入（参入（incorporationincorporation）具有选择功能。）具有选择功能。 DNA pol DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。因此实现其选择功能。 目录目录（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨（二

20、）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正认切除错配碱基并加以校正目录目录A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能目录目录三、复制中的解链伴有三、复制中的解链伴有DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DN

21、A解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质目录目录E. Coli 基因图基因图目录目录解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于供能，作用

22、于氢键，使氢键，使DNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶。引物的酶。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整态并保护单链的完整。 目录目录108局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态超螺旋状态n复制过程正超螺旋的形成：复制过程正超螺旋的形成：目录目录解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目录目录 既能水解

23、既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：目录目录拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n作

24、用机制：作用机制：目录目录n拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：目录目录四、四、DNA连接酶连接复制中产生的连接酶连接复制中产生的单链缺口单链缺口连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。n DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式：POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353nDNA连接酶的作用：连接酶的作用：目录目录 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的连接酶在复制中起最后接合

25、缺口的作用。作用。 在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目录目录提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中的引物或延长中的新链新链游离游离dNTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3 ,5 -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较目录

26、目录原核生物原核生物DNA复制过程复制过程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第第 三三 节节目录目录起始是复制中较为复杂的环节，在此过程起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成发体，形成复制叉并合成RNARNA引物。引物。需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供形成引发体，合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、一、复制的起始复制的起始目录目录E.coli复制

27、起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 （一）（一） DNA的解链的解链目录目录原核生物的复制起始部位及解链原核生物的复制起始部位及解链 目录目录目录目录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓

28、扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和引发体形成（二）引物合成和引发体形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。目录目录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录引发体和复制叉的生成引发体和复制叉的生成目录目录目录目录二、二、DNA链的延长链的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延

29、长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目录目录n领头链的合成：领头链的合成：领头链的子链沿着领头链的子链沿着5 5 33 方向可以连续地延长。方向可以连续地延长。n后随链的合成后随链的合成目录目录 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链复复制制过过程程简简图图目录目录目录目录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段，双向复制的复制片段在复制的终止点在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。ori

30、ter E.coli8232 ori terSV40500三、复制的终止三、复制的终止目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶n 子链中的子链中的RNA引物被取代引物被取代目录目录目录目录目录目录真核生物真核生物DNA生物合成生物合成过程过程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes第第 四四 节节目录目录真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生复制从引发进入延伸阶段发生DNA

31、聚聚合酶合酶 / 转换；转换；切除冈崎片段切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。 真核生物与原核生物真核生物与原核生物DNA复制的差异：复制的差异：目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关期这两个关键点。键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活的调节，与蛋白激酶活性有关。性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。而实施调控作用。 目录目录真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制真核生物

32、每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。激活而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物复制的起始与原核基本相似一、真核生物复制的起始与原核基本相似目录目录酵母复制起点为酵母复制起点为自主复制序列（自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色

33、体含有多个复制起点。酵母染色体含有多个复制起点。 元件元件A(富含富含A/T的共有序列的共有序列)：结合一个特异的蛋白质：结合一个特异的蛋白质复合物复合物复制起点识别复合物复制起点识别复合物(ORC)。 3个序列个序列(B1、B2和和B3)可以增加复制起点的效率，其可以增加复制起点的效率，其中中B2的的9个碱基与上述个碱基与上述ARS共有序列相同。共有序列相同。酵母复制起始点酵母复制起始点目录目录增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作在复制起始和延长中起关键作用。用。PCNA为同源三聚体，具有与

34、为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚聚合酶合酶的的亚基相同的功能和相似的构象，即形亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动成闭合环形的可滑动DNA夹子，在夹子，在RFC的作用下的作用下PCNA结合于引物模板链；并且结合于引物模板链；并且PCNA使使pol获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增水平也是检验细胞增殖的重要指标。殖的重要指标。目录目录拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋超螺旋Tol和和TolDNA双螺旋解链，参与组装引发体双螺旋解链，参与

35、组装引发体DNA解旋酶解旋酶连接冈崎片段连接冈崎片段DNA连接酶连接酶核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物RNAse H核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol / 合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引发酶引发酶有依赖有依赖DNA的的ATPase活性，结合于引物活性，结合于引物-模板链，激活模板链，激活DNA聚合酶，聚合酶， 促使促使PCNA结合于引物结合于引物-模板链模板链RFC激活激活DNA聚合酶和聚合酶和RFC的的ATPase活性活性PCNA单链单链DNA结合蛋白，激活结合蛋白，激活DNA聚合酶

36、，使解旋酶容易结合聚合酶，使解旋酶容易结合DNARPA功功 能能蛋白质蛋白质真核真核DNA复制叉主要蛋白质的功能复制叉主要蛋白质的功能目录目录 DNA-pol 和和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过通过PCNA的协同作用，逐步取代的协同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物的的3 -OH基础上连续合成领头链。随从链引物也基础上连续合成领头链。随从链引物也由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA协同，协同，pol 置换置换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 二、真核生物

37、复制的延长发生二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶聚合酶/转换转换目录目录 前导链：出现在引发后期前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换的原因是转换的原因是Pol 不具备不具备持续合成能力持续合成能力。 DNA聚合酶聚合酶 / 转换的转换的关键蛋白是关键蛋白是RFC。DNA聚合酶聚合酶 / 转换转换目录目录真核真核DNA聚聚合酶转换和合酶转换和后随链合成后随链合成目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA后随链后随链引物引物核小体核小体三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即组

38、装成核小体合成后立即组装成核小体目录目录染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题目录目录n切除引物的两种机制切除引物的两种机制目录目录前导链前导链产生产生完整完整的子染色单体。的子染色单体。后随链后随链3 3 端留下端留下缩短的缩短的未复制的未复制的ssDNA区区。5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3

39、 3 5 5 目录目录端粒（端粒（telomeres）由富含由富含TG的重复序列组成。的重复序列组成。人的端粒重复序列为人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3 。这些重复序列多为双链，但每个染色体的这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比端比5 端长，形成单链端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。染色体末端复制问题。目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP

40、1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) n组成：组成：目录目录端粒酶（端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（是一种核糖核蛋白（RNP），），由由RNA和蛋白质组成。和蛋白质组成。端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的组分作为模板，以染色体的3 端端ssDNA（后随链模板）（后随链模板）为引物，将端粒序列添加为引物，将端粒序列添加于染色体的于染色体的3 端。这些新合成的端。这些新合成的DNA为单链为单链。目录目录n端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 目录目录真核所有染

41、色体真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞复制仅仅出现在细胞周期的周期的S期期，而且只能复制一次。，而且只能复制一次。五、真核生物染色体五、真核生物染色体DNA在每个细胞周在每个细胞周期中只能复制一次期中只能复制一次目录目录前复制复合物在前复制复合物在G1期形成而在期形成而在S期被激活期被激活真核细胞真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制的起始分两步进行，即复复制基因的选择制基因的选择和和复制起点的激活。复制起点的激活。复制基因（复制基因（replicator）是指是指DNA复制起始复制起始所所必需的必需的全部全部DNA序列序列。目录目录 复制基因的选择复制基因的选择出现于出现于G1期期，

42、基因组的每个复，基因组的每个复制基因位点均组装制基因位点均组装前复制复合物（前复制复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。 复制起点的激活复制起点的激活出现于细胞进入出现于细胞进入S期期以后，这一以后，这一阶段将阶段将激活激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋，募集若干复制基因结合蛋白和白和DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。在原核细胞中，复制基因的识别与在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解解旋、募集旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在中，这两个阶段相分离可以确保每个染

43、色体在每个细胞周期中仅复制一次。每个细胞周期中仅复制一次。目录目录ORC至少募集两种解旋酶加载至少募集两种解旋酶加载蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。复制起点识别复合物（复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因。识别并结合复制基因。三种蛋白质一起募集真核细胞三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶解旋酶Mcm2-7。前复制复合物（前复制复合物（pre-RC）的形成）的形成目录目录pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其它复制因子磷酸化导致在复制起点组装其它复制因子并起始复制，复制因子包括并起始复制，复制因子包括3种种DNA聚合酶。聚合酶。DNA聚合酶

44、在复制起点按一定顺序组装：首先聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和和Pol 结合，然后是结合，然后是Pol /引发酶。引发酶。在在S期期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷）磷酸化，从而被激活。酸化，从而被激活。目录目录pre-RC的激活的激活和组装真核和组装真核DNA复制叉复制叉目录目录（1）激活）激活pre-RC，以起始，以起始DNA复制；复制；（2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-RC。CDK控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（酶（cyclin-dependent kin

45、ases，CDK）严格控制）严格控制pre-RC的形成和激活。的形成和激活。Cdk功能：功能：目录目录在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活，也仅有一次机会激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的因可形成新的pre-RC并迅速结合并迅速结合ORC。但在。但在S、G2和和M期，高活性的期，高活性的Cdk抑制抑制pre-RC的其它组分的其它组分结合结合ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的活性消失，新的的活性消失，新

46、的pre-RC才能形成。才能形成。目录目录逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第五节第五节目录目录 双链双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是病毒的遗传物质是RNA。原核生物的质粒。原核生物的质粒，真核生物的线粒体，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外，都是染色体外存在的存在的DNA。这些非染色体基因组，采用。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。特殊的方式进行复制。目录目录逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转

47、录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒的基因组一、逆转录病毒的基因组RNA以逆以逆转录机制复制转录机制复制目录目录n逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA目录目录 RNA病毒在细胞内复制成双链病毒在细胞内复制成双链DNA的的前病毒前病毒(provirus)。前病毒保留了。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过

48、病毒基因组通过基因重组基因重组(recombination)，参加，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为。这种重组方式称为整合整合(integration)。前病毒。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。 目录目录逆转录酶催化的逆转录酶催化的cDNA合成合成目录目录分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与

49、录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 n试管内合成试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA 逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目录目录二、逆转录的发现发展了中心法则二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能。样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆

50、转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注世纪初已注意到的病毒致癌理论。意到的病毒致癌理论。 目录目录三、真核生物线粒体三、真核生物线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制目录目录dNTPDNA-pol n D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。的复制形式。 三、真核生物线粒体三、真核生物线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制目录目录 D-环复制时需合成引物。环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复的复制。复制中呈字母制。复制中呈字母D形状而得名。形状而得名。 D环复制的特点是复制起始点不在双链环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一同一位点，内、外环复制有时序差别。位点，内、外环复制有时序差别。