重组DNA技术基础1

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1、与基因工程学科建立相关的1、4个里程碑事件：2、3大技术发现/发明：第二章第二章重组技术基础重组技术基础DNA组成与结构组成与结构一级结构一级结构 碱基的排列顺序碱基的排列顺序二级结构二级结构 DNADNA的双螺旋形式的双螺旋形式高级结构高级结构 DNADNA的超螺旋形式的超螺旋形式核酸核酸 分子组成分子组成DNA的分子结构的分子结构（一）核酸的分类（一）核酸的分类 90% 90%以上分布于以上分布于细胞核，细胞核，其余分布于其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。核外如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于分布于胞核、胞液。胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid, DNA)(rib

2、onucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。. .戊戊 糖糖（构成（构成RNA）12345OHOCH2OHOHOH -D-呋喃核糖呋喃核糖(ribose)（构成（构成DNA）OHOCH2OHOH -D-2-脱氧呋喃脱氧呋喃核糖核糖 (deoxyribose)2. 碱碱 基基嘌呤嘌呤(purine) 嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧

3、啶(cytosine, C)尿嘧啶尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine, T)腺嘌呤腺嘌呤(adenine, A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine, G)核苷：核苷：AR, GR, UR, CR脱氧核苷：脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR3. 核苷核苷(ribonucleoside)碱基碱基核糖（脱氧核糖）核糖（脱氧核糖） 连接方式：连接方式：CN 糖苷键糖苷键碱基（碱基（9 /1位）位） 戊糖（戊糖（1，位）位） OHOCH2OHOHNNNH2O11POOOHOHOCH2OHOHNNNH2O核苷酸：核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脱氧核苷酸：脱氧核

4、苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP . 核苷酸核苷酸(ribonucleotide)核苷（脱氧核苷）核苷（脱氧核苷）磷酸磷酸磷酸酯键磷酸酯键5 端端3 端端. . 核苷酸的连接核苷酸的连接 ，磷酸二酯键磷酸二酯键CGA二、核酸的一级结构二、核酸的一级结构定义：定义： 核酸中核苷酸的排列顺序核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）（碱基序列）。55端端3端端CGAA G P5 P T PG PC PT P OH 3 书写方法书写方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 竖式横式简化式DNA的空间结构的空间结构一、一、DNA的二级结构的二级结构（一）双螺

5、旋结构（一）双螺旋结构DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）u两条两条DNADNA单链分子单链分子反向反向平行平行环绕，环绕，右手螺旋走向，右手螺旋走向，表面表面大大沟与小沟相间。沟与小沟相间。u螺旋直径为螺旋直径为2nm， 主链主链：戊糖：戊糖 磷酸骨架位于外侧磷酸骨架位于外侧 侧链侧链：碱基对位于内侧：碱基对位于内侧u碱基平面垂直于螺旋轴碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：碱基距：0.34nm； 螺距：螺距： 3.4nm； 周长：周长：1 0对碱基对碱基。u碱基形成碱基形成氢键配对氢键配对，配对形，配对形式为：式为：A=T; G C） 。碱基互补配

6、对碱基互补配对 u稳定因素：稳定因素：1. 1.氢键氢键维持维持横向稳定性横向稳定性，2. 2.碱基堆积力碱基堆积力维持维持纵向稳定纵向稳定性性。3.介质中阳离子可以有效地介质中阳离子可以有效地屏蔽磷酸基之间的静电斥力屏蔽磷酸基之间的静电斥力 （二）与（二）与DNA碱基顺序相关的特殊结构碱基顺序相关的特殊结构 碱基顺序颠倒重复而具有碱基顺序颠倒重复而具有2倍对称的倍对称的DNA段落段落 镜像重复序列镜像重复序列 tsDNA是在DNA双螺旋结构的基础上形成的，三条链均为同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。（三）三

7、股螺旋（三）三股螺旋DNA（tsDNA,也称也称H-DNA ） Py-Pu-Py型，在偏酸性pH中稳定，较多见较多见 (四四) 酶活性酶活性DNA 1995年Cuenoud等发现了具有酶活性的DNA，再次丰富了酶学。 Cuenoud根据共有序列设计并合成了由47个核苷酸组成的单链DNA-E47，以此连接两个底物DNAS1和S2 二、二、DNA的超螺旋结构及其在染色质的超螺旋结构及其在染色质中的组装中的组装（一）（一）DNA的超螺旋结构的超螺旋结构超螺旋结构超螺旋结构(superhelix 或或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 正超螺旋正

8、超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 意义意义DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其变化及其调控调控对于对于DNA复制和复制和RNA转录过转录过程程具有关键作用。具有关键作用。 （二）原核生物（二）原核生物DNA的高级结构的高级结构（三）（三）DNA在真核生物细胞核内的组装在真核生物细胞核内的组装真核生物染色体由真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，和蛋白质构成，其基本单位是其基本单位是 核

9、小体核小体(nucleosome)。 DNA：约约200bp 组蛋白：组蛋白：H1 , H2A, H2B, H3, H4核小体的化学组成核小体的化学组成RNA的结构的结构Structure of RNARNA的种类、分布、功能的种类、分布、功能核蛋白体核蛋白体RNA信使信使RNA转运转运RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA胞浆小胞浆小RNA 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分核蛋白体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基

10、酸成熟成熟mRNA的前体的前体参与参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNA核蛋白体核蛋白体RNA信使信使RNA转运转运RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA胞浆小胞浆小RNA 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分核蛋白体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基酸成熟成熟mRNA的前体的前体参与参与hnRN

11、A的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNAmRNArRNAtRNA一一 、mRNA的结构与功能的结构与功能hnRNA 内含子内含子( (intron) )mRNA 外显子外显子( (exon) )* * 真核细胞真核细胞mRNA结构特点结构特点1. 5 末端有甲基化鸟苷帽子结构：末端有甲基化鸟苷帽子结构：m7GpppNm- 2. 3 末端有多聚腺苷酸尾巴：末端有多聚腺苷酸尾巴：PolyA。帽子结构帽子结构促进促进mRNA由胞核向胞质的转位由胞核向胞质的转位维持维持mRNA的稳定性的稳定

12、性翻译起始的调控翻译起始的调控 帽子结构和多聚帽子结构和多聚A尾的功能尾的功能* mRNA的功能的功能 把把DNA的碱基序列翻译成蛋白质的氨的碱基序列翻译成蛋白质的氨基酸顺序。基酸顺序。DNAmRNA蛋白蛋白转录转录翻译翻译原核细胞原核细胞 细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接转录后剪接转运转运mRNAhnRNA翻译翻译蛋白蛋白真核细胞真核细胞 * tRNA的一级结构特点的一级结构特点 含含 1020% 稀有碱基，如稀有碱基，如 DHU 3末端为末端为 CCA-OH 5末端大多数为末端大多数为G 具有具有 T C 二、转运二、转运RNA的结构与功能的结构与功

13、能* tRNA的二级结构的二级结构三叶草形三叶草形 氨基酸臂氨基酸臂 DHU环环 反密码环反密码环 额外环额外环 TC环环氨基酸氨基酸臂臂额外环额外环* tRNA的三级结构的三级结构 倒倒L形形* tRNA的功能的功能活化、搬运氨基活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。白质的翻译。* rRNA的结构的结构三、三、rRNA的结构与功能的结构与功能* rRNA的功能的功能参与组成核蛋白参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物体，作为蛋白质生物合成的场所。合成的场所。 rRNA的种类的种类真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物

14、5S rRNA23S rRNA16S rRNAS（沉降系数）：单位时间内的沉降速度（沉降系数）：单位时间内的沉降速度核核 酸酸 的的 理理 化化 性性 质质The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid1. 核酸的核酸的溶解度溶解度核酸是极性分子，微溶于水核酸是极性分子，微溶于水，不溶于乙醇或异丙醇。，不溶于乙醇或异丙醇。DNA+蛋白质蛋白质脱氧核糖核蛋白（脱氧核糖核蛋白（DNP）：）： 在在1 mol/L的的NaCl溶液中的溶解度最大。溶液中的溶解度最大。RNA+ +蛋白质蛋白质核糖核蛋白（核糖核蛋白（RNP）：）：在在0.14 mo

15、l/L的的NaCl溶液中的溶解度最大。溶液中的溶解度最大。一、核酸的一般理化性质一、核酸的一般理化性质 核酸属于两性电解质，但因为磷酸的核酸属于两性电解质，但因为磷酸的酸性较强，因此总体呈现酸性较强，因此总体呈现较强的酸性较强的酸性。具有较低的等电点。当溶液的具有较低的等电点。当溶液的pH 4时，时，呈多呈多负离子负离子状态，容易与金属离子结状态，容易与金属离子结合形成盐。合形成盐。3. 核酸核酸的高分子性质的高分子性质粘度：粘度： DNARNA dsDNA ssDNA4. 核酸核酸的紫外吸收的紫外吸收(OD260)单核苷酸单核苷酸 ssDNA(或或RNA) dsDNA5.核酸的化学性质 核酸

16、中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、脱氨、聚合、烷基化烷基化等反应等。脱氨：脱氨：CUCU脱氨：脱氨：CUCUA AT T C C G GA AA AT TT TG G C CA AT T U U G GA AA AT TT TA AC C千万年后，千万年后，G GC C 将不复存在将不复存在 聚合聚合 紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体紫外光诱导两个相邻嘧啶之间形成二聚体CH3NHNOOCH3NHNOORRPPPCH3NHNOOCH3NHNOORRPPP紫外光图3-25 胸腺嘧啶二聚体的形成二、二、DNA的变性的变性(denaturation)定义：定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作

17、用下，DNA双链解开双链解开成两条单链的过程。成两条单链的过程。方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：OD260增高增高粘度下降粘度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260

18、增高的现象。增高的现象。解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNADNA的过程中以温的过程中以温度对度对A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A260代表溶液在代表溶液在260nm260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线链曲线。 Tm：DNA变性时变性时紫外光吸收值达到紫外光吸收值达到最大值的最大值的50%时的时的温度称为温度称为DNA的解的解链温度，又称融解链温度，又称融解温 度温 度 ( m e l t i n g temperature, Tm)。影响影响Tm的因素：的因素： 1. G+C含

19、量含量: G+C越高，越高，Tm 越高越高 2. DNA样品均一性：样品均一性： 均一的均一的DNADNA样品，样品，Tm范围较狭窄。范围较狭窄。 3.3.核酸的种类：核酸的种类： 双链双链RNA RNA RNA-DNARNA-DNA杂交链杂交链 DNADNA双链双链 4.4.溶液的离子强度溶液的离子强度 ： 离子强度高，离子强度高，TmTm值高值高 。三、三、DNA的复性与分子杂交的复性与分子杂交 DNA复性复性(renaturation)的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称

20、为复性复性。减色效应减色效应 DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低的现象。降低的现象。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing) 。不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过不同来源的核酸链分子复性时形成杂化双链过程叫分子杂交。程叫分子杂交。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间形成，也可以在之间形成，也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。分子杂交。核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridiz

21、ation) 核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用l研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置l确定两种核酸分子间的序列相似性确定两种核酸分子间的序列相似性l检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否l是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 核核 酸酸 酶酶 核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶是指所有可以水解核酸的酶核酸酶的分类核酸酶的分类依据底物不同分类依据底物不同分类DNA酶酶(deoxyribonuclease, DNase)：专一降解专一降解DNA。RNA酶酶 (ribonuclease, RNase)：专一降解专一降解RNA。依据切割

22、部位不同依据切割部位不同核酸内切酶：核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。特异性限制性核酸内切酶。核酸外切酶：核酸外切酶：5 3 或或3 5 核酸外切酶。核酸外切酶。u参与参与DNA的合成与修复、的合成与修复、RNA合成后的剪合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程接等重要基因复制和基因表达过程 u负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 u在消化液中降解食物中的核酸以利吸收在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 u体外重组体外重组DNA技术中的重要工具酶技术中的重要工具酶 生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解 核酸酶的功能核酸酶的功能 核核 酶酶u 催化性催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。 u 催化性催化性RNA (ribozyme) 作为序列特异性的核作为序列特异性的核酸内切酶降解酸内切酶降解mRNA。