高致病性禽流感防治技术要求规范

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1、word一、高致病性禽流感防治技术规高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。为预防、控制和扑灭高致病性禽流感，依据中华人民国动物防疫法、重大动物疫情应急条例、国家突发重大动物疫情应急预案及有关的法律法规制定本规。1 适用围本规规定了高致病性禽流感的疫情确认、疫情处置、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程序、技术标准及保障措施。本规适用于中华人民国境一切与高致病性禽流感防治活动有关的单位和个人。2

2、诊断2.1 流行病学特点2.1.1 鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感，多种野鸟也可感染发病。2.1.2 传染源主要为病禽（野鸟）和带毒禽（野鸟）。病毒可长期在污染的粪便、水等环境中存活。2.1.3 病毒传播主要通过接触感染禽（野鸟）及其分泌物和排泄物、污染的饲料、水、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等媒介，经呼吸道、消化道感染，也可通过气源性媒介传播。2.2 临床症状2.2.1 急性发病死亡或不明原因死亡，潜伏期从几小时到数天，最长可达21天；2.2.2 脚鳞出血；2.2.3 鸡冠出血或发绀、头部和面部水肿；2.2.4 鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状，有时可见角膜

3、炎症，甚至失明；2.2.5 产蛋突然下降。2.3 病理变化2.3.1 消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血；腺胃粘液增多，可见腺胃乳头出血，腺胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血；2.3.2 心冠及腹部脂肪出血；2.3.3 输卵管的中部可见乳白色分泌物或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂,有的可见“卵黄性腹膜炎”；2.3.4脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细胞管套、神经胶质灶、血管增生等病变；胰腺和心肌组织局灶性坏死。2.4 血清学指标2.4.1 未免疫禽H5或H7的血凝抑制(HI)效价达到24及以上（附件1）；2.4.2 禽流感琼脂免疫扩散试验（AGID）阳性(附件2)。2.5 病原学指标2.5.1 反

4、转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测，结果H5或H7亚型禽流感阳性（附件4）；2.5.2 通用荧光反转录-聚合酶链反应（荧光RT-PCR）检测阳性（附件6）；2.5.3 神经氨酸酶抑制（NI）试验阳性（附件3）；2.5.4 静脉接种致病指数（IVPI）大于1.2或用0.2ml 1:10稀释的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液，经静脉注射接种8只4-8周龄的易感鸡，在接种后10天，能致6-7只或8只鸡死亡，即死亡率75%；2.5.5 对血凝素基因裂解位点的氨基酸序列测定结果与高致病性禽流感分离株基因序列相符（由国家参考实验室提供方法）。2.6 结果判定2.6.1 临床怀疑病例符合流行病学特点和临床指

5、标2.2.1，且至少符合其他临床指标或病理指标之一的;非免疫禽符合流行病学特点和临床指标2.2.1且符合血清学指标之一的。2.6.2 疑似病例临床怀疑病例且符合病原学指标2.5.1、2.5.2、2.5.3之一。2.6.3 确诊病例疑似病例且符合病原学指标2.5.4或2.5.5。3 疫情报告3.1 任何单位和个人发现禽类发病急、传播迅速、死亡率高等异常情况，应及时向当地动物防疫监督机构报告。3.2 当地动物防疫监督机构在接到疫情报告或了解可疑疫情情况后，应立即派员到现场进行初步调查核实并采集样品，符合2.6.1规定的，确认为临床怀疑疫情；3.3 确认为临床怀疑疫情的，应在2个小时将情况逐级报到省

6、级动物防疫监督机构和同级兽医行政管理部门，并立即将样品送省级动物防疫监督机构进行疑似诊断；3.4 省级动物防疫监督机构确认为疑似疫情的，必须派专人将病料送国家禽流感参考实验室做病毒分离与鉴定，进行最终确诊；经确认后，应立即上报同级人民政府和国务院兽医行政管理部门，国务院兽医行政管理部门应当在4个小时向国务院报告；3.5 国务院兽医行政管理部门根据最终确诊结果，确认高致病性禽流感疫情。4 疫情处置4.1 临床怀疑疫情的处置对发病场（户）实施隔离、监控，禁止禽类、禽类产品及有关物品移动，并对其、外环境实施严格的消毒措施（附件8）。4.2 疑似疫情的处置当确认为疑似疫情时，扑杀疑似禽群，对扑杀禽、病

7、死禽及其产品进行无害化处理，对其、外环境实施严格的消毒措施，对污染物或可疑污染物进行无害化处理，对污染的场所和设施进行彻底消毒，限制发病场（户）周边3公里的家禽及其产品移动（见附件9、10）。4.3 确诊疫情的处置疫情确诊后立即启动相应级别的应急预案。4.3.1 划定疫点、疫区、受威胁区由所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。疫点：指患病动物所在的地点。一般是指患病禽类所在的禽场（户）或其它有关屠宰、经营单位；如为农村散养，应将自然村划为疫点。疫区：由疫点边缘向外延伸3公里的区域划为疫区。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环境和天然屏障（如河流、山脉等）。受威胁区：由疫区边缘向

8、外延伸5公里的区域划为受威胁区。4.3.2 封锁由县级以上兽医主管部门报请同级人民政府决定对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应在24小时发布封锁令，对疫区进行封锁：在疫区周围设置警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，对出入的车辆和有关物品进行消毒。必要时，经省级人民政府批准，可设立临时监督检查站，执行对禽类的监督检查任务。跨行政区域发生疫情的，由共同上一级兽医主管部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令，对疫区进行封锁。4.3.3 疫点应采取的措施4.3.3.1 扑杀所有的禽只，销毁所有病死禽、被扑杀禽及其禽类产品；4.3.3.2 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害

9、化处理；4.3.3.3 对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。4.3.4 疫区应采取的措施4.3.4.1扑杀疫区所有家禽，并进行无害化处理，同时销毁相应的禽类产品；4.3.4.2 禁止禽类进出疫区及禽类产品运出疫区；4.3.4.3 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处理；4.3.4.4 对所有与禽类接触过的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。4.3.5 受威胁区应采取的措施4.3.5.1 对所有易感禽类进行紧急强制免疫，建立完整的免疫档案；4.3.5.2 对所有禽类实行疫情监测，掌握疫情动态。4.3.6 关闭疫点及周边13公里所有家禽及其

10、产品交易市场。4.3.7 流行病学调查、疫源分析与追踪调查追踪疫点在发病期间及发病前21天售出的所有家禽及其产品，并销毁处理。按照高致病性禽流感流行病学调查规，对疫情进行溯源和扩散风险分析（附件11）。4.3.8 解除封锁4.3.8.1 解除封锁的条件疫点、疫区所有禽类及其产品按规定处理完毕21天以上，监测未出现新的传染源；在当地动物防疫监督机构的监督指导下，完成相关场所和物品终末消毒；受威胁区按规定完成免疫。4.3.8.2 解除封锁的程序经上一级动物防疫监督机构审验合格，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的人民政府申请发布解除封锁令，取消所采取的疫情处置措施。4.3.8.3 疫区解除封锁后，要

11、继续对该区域进行疫情监测，6个月后如未发现新病例，即可宣布该次疫情被扑灭。疫情宣布扑灭后方可重新养禽。4.3.9 对处理疫情的全过程必须做好完整详实的记录，并归档。5 疫情监测5.1 监测方法包括临床观察、实验室检测及流行病学调查。5.2 监测对象以易感禽类为主，必要时监测其他动物。5.3.1 对养禽场户每年要进行两次病原学抽样检测，散养禽不定期抽检，对于未经免疫的禽类以血清学检测为主；5.3.2 对交易市场、禽类屠宰厂（场）、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的病原学和血清学监测。5.3.3 对疫区和受威胁区的监测5.3.3.1 对疫区、受威胁区的易感动物每天进行临床观察，连续1个月，病死禽送

12、省级动物防疫监督机构实验室进行诊断，疑似样品送国家禽流感参考实验室进行病毒分离和鉴定。解除封锁前采样检测1次，解除封锁后纳入正常监测围；5.3.3.2 对疫区养猪场采集鼻腔拭子，疫区和受威胁区所有禽群采集气管拭子和泄殖腔拭子，在野生禽类活动或栖息地采集新鲜粪便或水样，每个采样点采集20份样品，用RT-PCR方法进行病原检测，发现疑似感染样品，送国家禽流感参考实验室确诊。5.5 在监测过程中，国家规定的实验室要对分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性分析与评价，密切注意病毒的变异动态，及时向国务院兽医行政管理部门报告。5.6 各级动物防疫监督机构对监测结果及相关信息进行风险分析，做好预警预报。监

13、测结果逐级汇总上报至中国动物疫病预防控制中心。发现病原学和非免疫血清学阳性禽，要按照国家动物疫情报告管理办法的有关规定立即报告，并将样品送国家禽流感参考实验室进行确诊，确诊阳性的，按有关规定处理。6 免疫6.1 国家对高致病性禽流感实行强制免疫制度，免疫密度必须达到100%，抗体合格率达到70%以上。6.2 预防性免疫，按农业部制定的免疫方案中规定的程序进行。6.3 突发疫情时的紧急免疫，按本规有关条款进行。6.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的产品，并由动物防疫监督机构统一组织、逐级供应。6.5 所有易感禽类饲养者必须按国家制定的免疫程序做好免疫接种，当地动物防疫监督机构负责监督指导。6.

14、6 定期对免疫禽群进行免疫水平监测，根据群体抗体水平及时加强免疫。7 检疫监督饲养者在禽群及禽类产品离开产地前，必须向当地动物防疫监督机构报检，接到报检后，必须及时到户、到场实施检疫。检疫合格的，出具检疫合格证明，并对运载工具进行消毒，出具消毒证明，对检疫不合格的按有关规定处理。动物防疫监督机构的检疫人员对屠宰的禽只进行验证查物，合格后方可入厂（场）屠宰。宰后检疫合格的方可出厂，不合格的按有关规定处理。国异地引入种禽、种蛋时，应当先到当地动物防疫监督机构办理检疫审批手续且检疫合格。引入的种禽必须隔离饲养21天以上，并由动物防疫监督机构进行检测，合格后方可混群饲养。7.4.1禽类和禽类产品凭检疫

15、合格证运输、上市销售。动物防疫监督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫情传播扩散。7.4.2生产、经营禽类及其产品的场所必须符合动物防疫条件，并取得动物防疫合格证。7.4.3各地根据防控高致病性禽流感的需要设立公路动物防疫监督检查站，对禽类及其产品进行监督检查，对运输工具进行消毒。8 保障措施8.1 各级政府应加强机构队伍建设，确保各项防治技术落实到位。8.2 各级财政和发改部门应加强基础设施建设，确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化处理、消毒等防治工作经费落实。8.3 各级兽医行政部门动物防疫监督机构应按本技术规，加强应急物资储备，及时演练和培训应急队伍。8.4 在高致病禽流感防控中，人员的防

16、护按高致病性禽流感人员防护技术规执行（附件12）。附件1血凝抑制（HI）试验流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。HA-HI试验的优点是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，可用来鉴定所有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清中的感染或免疫抗体。它的缺点是只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI象，

17、各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素，对于其它禽种，也可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。1 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约24mL，与阿氏

18、液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经15001800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经15001800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4保存备用，不超过5天。2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心15001800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。2.4 1

19、%鸡红细胞液 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1 在微量反应板的1孔12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。3.2吸取0.025mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第l孔，混匀。3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。3.4每孔再加入0.025mL PBS。3.5每孔均加入0.025mL 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。3.6振荡混匀，在室温（2025

20、）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。表1：血凝试验结果判读标准类别孔 底 所 见结果12345红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集+-能使红细胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验

21、无效。4 血凝抑制（HI）试验（微量法）4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2 在微量反应板的1孔11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。4.4 1孔11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温（约20）静置至少30min。4

22、.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20，若环境温度太高可置4条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6 结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2为阳性。附件2琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验A型流感病毒都有抗原性相似的核衣壳和基质抗原。用已知禽流感AGID标准血清可以检测是否有A型流感病毒的存在，一般在

23、鉴定所分禽的病毒是否是A型禽流感病毒时常用，此时的抗原需要试验者自己用分离的病毒制备；利用AGID标准抗原，可以检测所有A型流感病毒产生的各个亚型的禽流感抗体，通常在禽流感监测时使用(水禽不适用)，可作为非免疫鸡和火鸡感染的证据，其标准抗原和阳性血清均可由国家指定单位提供。流感病毒感染后不是所有的禽种都能产生沉淀抗体。1 抗原制备1.1 用含丰富病毒核衣壳的尿囊膜制备。从尿囊液呈HA阳性的感染鸡胚中提取绒毛尿囊膜，将其匀浆或研碎，然后反复冻融三次，经1000r/m离心10分钟，弃沉淀，取上清液用0.1%福尔马林或1%-丙酯灭活后可作为抗原。1.2 用感染的尿囊液将病毒浓缩或者用已感染的绒毛尿囊

24、膜的提取物，这些抗原用标准血清进行标定。将含毒尿囊液以超速离心或者在酸性条件下进行沉淀以浓缩病毒。酸性沉淀法是将1.0mol/LHCl加入到含毒尿囊液中，调pH值到4.0，将混合物置于冰浴中作用1小时，经1000r/m，4离心10分钟，弃去上清液。病毒沉淀物悬于甘氨-肌氨酸缓冲液中（含1%十二烷酰肌氨酸缓冲液，用0.5 mol/L甘氨酸调pH值至9.0）。沉淀物中含有核衣壳和基质多肽。2 琼脂板制备该试验常用1g优质琼脂粉或0.81g 琼脂糖加入100 mL0.01mol/L、pH值7.2的8%氯化钠-磷酸缓冲液中，水浴加热融化，稍凉（6065），倒入琼脂板（厚度为3mm），待琼脂凝固后，4冰

25、箱保存备用。用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3 mm 4mm，孔距为3mm。3 加样用移液器滴加抗原于中间孔，周围1、4孔加阳性血清，其余孔加被检血清，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头,并设阴性对照血清。4 感作将琼脂板加盖保湿，置于37温箱。2448小时后，判定结果。5 结果判定5.1 阳性。阳性血清与抗原孔之间有明显沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线，并与阳性血清的沉淀线末端吻合，则被检血清判为阳性。5.2 弱阳性。被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱阳性（需重复试验）。5.3 阴性。被检血清与抗原孔之

26、间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。附件3神经氨酸酶抑制（NI）试验神经氨酸酶是流感病毒的两种表面糖蛋白之一，它具有酶的活性。NA与底物(胎球蛋白)混合，37温育过夜，可使胎球蛋白释放出唾液酸，唾液酸经碘酸盐氧化，经硫代巴比妥酸作用形成生色团，该生色团用有机溶剂提取后便可用分光光度计测定。反应中出现的粉红色深浅与释放的唾液酸的数量成比例，即与存在的流感病毒的数量成比例。在进行病毒NA亚型鉴定时，当已知的标准NA分型抗血清与病毒NA亚型一致时，抗血清就会将NA中和，从而减少或避免了胎球蛋白释放唾液酸，最后不出现化学反应，即看不到粉红色出现，则表明血清对NA抑制阳性

27、。该试验可用于分离株NA亚型的鉴定，也可用于血清中NI抗体的定性测定。1 溶液配置1.1胎球蛋白：48-50mg/ml; 1.2过碘酸盐：4.28克过碘酸钠+38 ml无离子水+62 ml浓正磷酸，充分混合，棕色瓶存放；1.3砷试剂：10克亚砷酸钠+7.1克无水硫酸钠+100 ml无离子水+0.3 ml 浓硫酸；1.4硫代巴比妥酸：1.2克硫代巴比妥酸+14.2克无水硫酸钠+200 ml无离子水，煮沸溶解，使用期一周。2 操作方法2.1 按下图所示标记试管N1原液 N1 10倍 N1 100倍 N1 1000倍N2原液 N2 10倍 N2 100倍 N2 1000倍阴性血清原液 阴性血清10倍

28、 阴性血清100倍 阴性血清1000倍2.2 将N1、N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100倍稀释，并分别加入标记好的相应试管中。2.3 将已经确定HA亚型的待检鸡胚尿囊液稀释至HA价为16倍，每管均加入0.05ml，混匀37水浴1小时。2.4 每管加入的胎球蛋白溶液（50mg/ml）0.1ml，混匀，拧上盖后37水浴16-18小时。2.5 室温冷却后，每管加入0.1ml过碘酸盐混匀，室温静置20分钟。2.6 每管加入1ml砷试剂，振荡至棕色消失乳白色出现。2.7 每管加入2.5ml硫代巴比妥酸试剂，将试管置煮沸的水浴中15分钟，不出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性，即待检病毒的神

29、经氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨酸酶分型血清亚型一致。附件4反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。鉴于RT-PCR方法的敏感性和特异性，引物的选择是最为重要的，通常引物是以已知序列为基础设计的，大量掌握国分离株的序列是设计特异引物的前题和基础。利用RT-PCR的通用引物可以检测是否有A型流感病毒的存在，亚型特异性引物则可进行禽流感的分型诊断和禽流感病毒的亚型鉴定。1 试剂/引物1.3 水饱和酚（pH 4.0）1.5 M-MLV反转录酶（200u/L）1.6 RNA酶抑制剂(40u/L)1.7 Ta

30、q DNA聚合酶(5u/L)1.9 501.10 溴化乙锭(10g/1.13 5反转录反应缓冲液（附录A.9）1.14 2.5mmol dNTPs（附录A.10）1.15 10PCR Buffer（附录A.11）1.16 DNA分子量标准1.17 引物：见附录B2 操作程序2.1 样品的采集和处理：按照GB/T 18936中提供方法进行。2.2 RNA的提取2.2.1 设立阳性、阴性样品对照。2.2.2 异硫氰酸胍一步法2.2.2.1 向组织或细胞中加入适量的变性液，匀浆。2.2.2.2 将混合物移至一管中，按每毫升变性液中立即加入0.1mL乙酸钠，1mL酚，0.2ml氯仿-异戊醇。加入每种组

31、分后，盖上管盖，倒置混匀。2.2.2.3 将匀浆剧烈振荡10s。冰浴15min使核蛋白质复合体彻底裂解。2.2.2.4 12000r/min，4离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。2.2.2.5 加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，并在-20沉淀RNA 1h或更长时间。2.2.2.6 4 12000 r/min离心10 min，弃上清，用75%的乙醇洗涤沉淀，离心，用吸头彻底吸弃上清，自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中。-20贮存，备用。2.2.3 也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA

32、的提取。L RNA，加1L反转录引物，70作用5min。2.3.2冰浴2min。2.3.3继续加入：5反转录反应缓冲液 4L0.1M DTT 2L2.5mmol dNTPs 2LLLDEPC水 11L 37水浴1h，合成cDNA链。取出后可直接进行PCR，或者放于-20保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。2.4 PCR根据扩增目的不同，选择不同的上/下游引物，M-229U/M-229L是型特异性引物，用于扩增禽流感病毒的M基因片段；H5-380U/H5-380L、H7-501U/H7-501L、H9-732U/H9-732L分别特异性扩增H5、H7、H9亚型血凝素基因片段；N1-358U/

33、N1-358L、N2-377U/N2-377L分别特异性扩增N1、N2亚型神经氨酸酶基因片段。PCR为50L体系，包括：L反转录产物 4LLL10PCR Buffer 5L2.5mmol dNTPs 2LL首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入1滴液体石蜡(约20L)。循环参数为955min，94 45s，52 45s，72 45s，循环30次，72延伸6min结束。设立阳性对照和阴性对照。2.5.1 制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.4。2.5.2 取5 L加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶

34、板的加样孔中。2.5.3加入分子量标准。2.5.4盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳，3040min。2.5.5用紫外凝胶成像仪观察、扫描图片存档，打印。2.5.6 用分子量标准比较判断PCR片段大小。3 结果判定3.1在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带时判定结果。3.2用M-229U/M-229L检测，出现大小为229bp扩增片段时，判定为禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3.3用H5-380U/H5-380L检测，出现大小为380bp扩增片段时，判定为H5血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3.4用H7-501U/H7-501L检测，出现大小为501bp扩增片段时，判定

35、为H7血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3.5用H9-732U/H9-732L检测，出现大小为732bp扩增片段时，判定为H9血凝素亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3.6用N1-358U/N1-358L检测，出现大小为358bp扩增片段时，判定为N1神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。3.7用N2-377U/N2-377L检测，出现大小为377bp扩增片段时，判定为N2神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性，否则判定为阴性。附 录A相关试剂的配制A.1 变性液4M 异硫氰酸胍2O0.5%（m/V） 十二烷基肌酸钠0.1M -巯基乙醇具体配制：将250g异硫氰酸胍、0.75M（ PH

36、7.0）柠檬酸钠17.6ml和26.4ml 10%（m/V）十二烷基肌酸钠溶于293ml水中。65条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次临用前按每50ml变性液加14.4 mol/L的-巯基乙醇0.36ml的剂量加入。变性液可在室温下避光保存数月。A.2 2mol/L醋酸钠溶液(pH4.0)乙酸钠16.4 g冰乙酸灭菌双蒸水加至100 mLA.3 氯仿/异戊醇混合液氯仿49 mL异戊醇1 mLA.4 1.0%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖1.0 gTAE电泳缓冲液加至100 mL微波炉中完全融化，待冷至50-60时，加溴化乙锭（EB）溶液5L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A

37、.5 50TAE电泳缓冲液A.5.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠18.61 g灭菌双蒸水80 mL氢氧化钠灭菌双蒸水加至100 mLA.5.2 TAE电泳缓冲液(50)配制羟基甲基氨基甲烷(Tris)242 g冰乙酸57.1 mL0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(PH8.0)100 mL灭菌双蒸水加至1 000 mL用时用灭菌双蒸水稀释使用A.6 溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20 mg灭菌双蒸水加至20 mLA.7 10加样缓冲液聚蔗糖25 g灭菌双蒸水100 mL溴酚蓝0.1 g二甲苯青0.1 gA.8 DEPC水超纯水100

38、mL焦碳酸二乙酯(DEPC)50L室温过夜，121高压15min，分装到1.5 mL DEPC处理过的微量管中。A.9 M-MLV 反转录酶5反应缓冲液 1moL Tris-HCl (pH 8.3)5 mLKCl0.559 gMgCl20.029 gDTT0.154 g灭菌双蒸水加至100 mLdATP(10mmol/L)20 LdTTP(10mmol/L)20 LdGTP(10mmol/L)20 LdCTP(10mmol/L)20 LA.11 10PCR缓冲液1M Tris-HCl (pH8.8) 10 mL1M KCl50 mLNonidet P400.8 mL1.5moL MgCl21

39、mL灭菌双蒸水加至100 mL附录B禽流感病毒RT-PCR试验用引物B.1 反转录引物Uni 12:5-AGCAAAAGCAGG-3，引物浓度为20pmol。B.2 PCR引物见下表，引物浓度均为20pmol。B.2 PCR过程中选择的引物引物名称引物序列长度(bp)扩增目的M-229U5-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3229通用引物M-229L5-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3H5-380U5-AGTGAATTGGAATATGGTAACTG-3380H5H5-380L5-AACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT-3H7-501U5-AATGCACARGGAGG

40、AGGAACT-3501H7H7-501L5-TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA-3H9-732U5-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3732H9H9-732L5-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3N1-358U5-ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC-3358N1N1-358L5-GTCWCCGAAAACYCCACTGCA-3N2-377U5-GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG-3377N2N2-377L5-GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA-3W = (AT)；Y = (CT)；R = (AG)。附件5禽流

41、感病毒致病性测定高致病性禽流感是指由强毒引起的感染，感染禽有时可见典型的高致病性禽流感特征，有时则未见任何临床症状而突然死亡。所有分离到的高致病性病毒株均为H5或H7亚型，但大多数H5或H7亚型仍为弱毒株。评价分离株是否为高致病性或者是潜在的高致病性毒株具有重要意义。1 欧盟国家对高致病性禽流感病毒判定标准接种6周龄的SPF鸡，其IVPI大于1.2的或者核苷酸序列在血凝素裂解位点处有一系列的连续碱性氨基酸存在的H5或H7亚型流感病毒均判定为高致病性病毒。静脉接种指数（IVPI）测定方法：收获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液，测定其血凝价1/16（24或lg24）将含毒尿囊液用灭菌生理盐水稀释

42、10倍（切忌使用抗生素），将此稀释病毒液以0.1mL/羽静脉接种10只6周龄SPF鸡,2只同样鸡只接种0.1mL稀释液作对照（对照鸡不应发病，也不计入试验鸡）。每隔24小时检查鸡群一次，共观察10天。根据每只鸡的症状用数字方法每天进行记录：正常鸡记为0，病鸡记为1，重病鸡记为2，死鸡记为3（病鸡和重病鸡的判断主要依据临床症状表现。一般而言，“病鸡”表现有下述一种症状，而“重病鸡”则表现下述多个症状，如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和/或肉髯发绀、脸和/或头部肿胀、神经症状。死亡鸡在其死后的每次观察都记为3）。 IVPI值每只鸡在10天所有数字之和/（10只鸡10天），如指数为3.00，说明所有鸡2

43、4小时死亡；指数为0.00，说明10天观察期没有鸡表现临床症状。当IVPI值大于1.2时，判定分离株为高致病性禽流感病毒（HPAIV）。IVPI测定举例：(数字表示在特定日期表现出临床症状的鸡只数量)临床症状1D2D3D4D5D6D7D8D9D10总计数值正常10100000000020 x 0= 0发病00300000003 x 1= 3麻痹004510000010 x 2= 20死亡00359101010101067 x 3= 201总计= 2242 OIE对高致病性禽流感病毒的分类标准2.1 取HA滴度1/16的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液用等渗生理盐水1:10稀释，以0.2mL羽的剂量

44、翅静脉接种8只48周龄SPF鸡，在接种10天，能导致6只或6只以上鸡死亡，判定该毒株为高致病性禽流感病毒株。2.2 如分离物能使15只鸡致死，但病毒不是H5或H7亚型，则应进行下列试验：将病毒接种于细胞培养物上，观察其在胰蛋白酶缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果病毒不能在细胞上生长，则分离物应被考虑为非高致病性禽流感病毒。2.3所有低致病性的H5和H7毒株和其它病毒，在缺乏胰蛋白酶的细胞上能够生长时，则应进行与血凝素有关的肽链的氨基酸序列分析，如果分析结果同其它高致病性流感病毒相似，这种被检验的分离物应被考虑为高致病性禽流感病毒。附件6禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测1 材料与试剂1.1

45、 仪器与器材荧光RT-PCR检测仪高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）台式离心机（离心速度3000r/min）混匀器冰箱（28和-20两种）微量可调移液器（10L、100L、1000L）及配套带滤芯吸头Eppendorf管（1.5mL）1.2 试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。氯仿；异丙醇：-20 预冷；PBS：1212，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 U/mL；75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB 6682 要求）配制，-20预冷。禽流感病毒通

46、用型荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项见附录。2 抽样2.1 采样工具下列采样工具必须经（1212），15min高压灭菌并烘干：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5ml Eppendorf管、研钵。2.2 样品采集1)活禽取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3-5次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；将拭子一并放入盛有1.0mL PBS的1.5mL Eppendorf管中，加盖、编号。2)肌肉或组织脏器待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。3)血清、血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppe

47、ndorf管中，编号备用。2.3 样品贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。2.4 样品制备1)咽喉、泄殖腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。2)肌肉或组织脏器取待检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL PBS混匀，4，3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中，编号备用。2.5 样本存放制备的样本在28条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置-7

48、0以下，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。3 操作方法3.1 实验室标准化设置与管理禽流感病毒通用荧光RTPCR检测的实验室规。3.2 样本的处理在样本制备区进行。 取n 个灭菌的1.5mL Eppendorf管，其中n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），编号。 每管加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200L，一份样本换用一个吸头，再加入200L氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4、12000r/min离心15min。 取与相同数量灭菌的1.5mL Eppendorf管，加入500

49、L异丙醇（-20预冷），做标记。吸取本标准各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500L，不能吸出中间层，颠倒混匀。 于4、12 000r/min离心15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入600 L 75乙醇，颠倒洗涤。 于4 、12000 r/min离心10min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。 4000 r/min 离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放

50、置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA 不溶。 加入11 L DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA， 2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h进行PCR扩增；若需长期保存须放置-70冰箱。3.3 检测 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制如下：RT-

51、PCR反应液15n颗RT-PCR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15L，转移至样本处理区。 加样在样本处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理中制备的RNA溶液各10L，盖紧管盖，500r/min离心30s。 荧光RT-PCR检测在检测区进行。将本标准中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪，记录样本摆放顺序。循环条件设置：第一阶段，反转录42/30 min；第二阶段，预变性92/3 min；第三阶段，92/10s，45/30s，72/1 min，5个循环；第四阶段，92/10s，60/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集

52、荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。4 结果判定4.1 结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。4.2 质控标准 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。 阳性对照的Ct值应28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。4.3 结果描述及判定 阴性无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒。 阳性Ct值30，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在禽流感病毒。 有效原则Ct30的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。附 录6试剂盒的组成1 试剂盒组成每个试剂盒可做48个检测，

53、包括以下成分：裂解液 30 mL1盒DEPC水 1 mL1管RT-PCR反应液（含禽流感病毒的引物、探针） 750 L1管RT-PCR酶 1颗/管12管Taq酶 12 L1管阴性对照 1 mL1管阳性对照（非感染性体外转录RNA） 1 mL1管2 说明2.1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4保存。2.2 DEPC水，用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。2.3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。3 功能试剂盒可用于禽类相关样品（包括肌肉组织、脏器、咽喉拭子、泄殖腔拭子、血清或血浆等）中禽流感病毒的检测。4 使用时的注意事项4.

54、1 在检测过程中，必须严防不同样品间的交叉污染。4.2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器保存， 使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。附件7样品采集、保存和运输活禽病料应包括气管和泄殖腔拭子，最好是采集气管拭子。小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。将每群采集的10份棉拭子，放在同一容器，混合为一个样品；容器中放有含有抗菌素的pH值为7.0-7.4的 PBS液。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000

55、IU/mL）、链霉素（2mg/mL），庆大霉素（50g/mL），制霉菌素（1000IU/mL）。但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后 pH值应调至7.0-7.4。样品应密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷剂的容器中运输，容器必须密封，防止渗漏。样品若能在24小时送到实验室，冷藏运输。否则，应冷冻运输。若样品暂时不用，则应冷冻（最好-70或以下）保存。采 样 单样品名称样品编号采样基数采样数量采样日期保存情况冷冻（藏）被采样单位通讯地址联系邮 编被采样单位盖章或签名年月日采样单位盖章 采样人签名 年月日备注：(如禽流感的免疫情况以及20天是否进行过其它免疫注射或异常刺激)此单一式

56、三份，第一联存根，第二联随样品，第三联由被采样单位保存附件8消毒技术规1 设备和必需品1.1 清洗工具：扫帚、叉子、铲子、锹和冲洗用水管。1.2 消毒工具：喷雾器、火焰喷射枪、消毒车辆、消毒容器等。1.3 消毒剂：清洁剂、醛类、强碱、氯制剂类等合适的消毒剂。1.4 防护装备：防护服、口罩、胶靴、手套、护目镜等。2 圈舍、场地和各种用具的消毒2.1 对圈舍及场地外采用喷洒消毒液的方式进行消毒，消毒后对污物、粪便、饲料等进行清理；清理完毕再用消毒液以喷洒方式进行彻底消毒，消毒完毕后再进行清洗；不易冲洗的圈舍清除废弃物和表土，进行堆积发酵处理。2.2 对金属设施设备，可采取火焰、熏蒸等方式消毒；木质

57、工具及塑料用具采取用消毒液浸泡消毒；工作服等采取浸泡或高温高压消毒。3 疫区可能被污染的场所应进行喷洒消毒。4 污水沟、水塘可投放生石灰或漂白粉。5 运载工具清洗消毒5.1 在出入疫点、疫区的交通路口设立消毒站点，对所有可能被污染的运载工具应当严格消毒。5.2 从车辆上清理下来的废弃物按无害化处理。6 疫点每天消毒1次连续1周，1周以后每两天消毒1次。疫区疫点以外的区域每两天消毒1次。附件9扑杀方法1 窒息先将待扑杀禽装入袋中，置入密封车或其它密封容器，通入二氧化碳窒息致死；或将禽装入密封袋中，通入二氧化碳窒息致死。2 扭颈扑杀量较小时采用。根据禽只大小，一手握住头部，另一手握住体部，朝相反方

58、向扭转拉伸。3 其它可根据本地情况，采用其它能避免病原扩散的致死方法。扑杀人员的防护符合NY/T 768高致病性禽流感人员防护技术规的要求。附件10无害化处理 所有病死禽、被扑杀禽及其产品、排泄物以及被污染或可能被污染的垫料、饲料和其它物品应当进行无害化处理。清洗所产生的污水、污物进行无害化处理。 无害化处理可以选择深埋、焚烧或高温高压等方法，饲料、粪便可以发酵处理。1深埋应当避开公共视线，选择地表水位低、远离学校、公共场所、居民住宅区、动物饲养场、屠宰场及交易市场、村庄、饮用水源地、河流等的地域。位置和类型应当有利于防洪。1.2坑的覆盖土层厚度应大于1.5米，坑底铺垫生石灰，覆盖土以前再撒一

59、层生石灰。1.3禽类尸体置于坑中后，浇油焚烧，然后用土覆盖，与周围持平。填土不要太实，以免尸腐产气造成气泡冒出和液体渗漏。1.4饲料、污染物等置于坑中，喷洒消毒剂后掩埋。2工厂化处理将所有病死牲畜、扑杀牲畜及其产品密封运输至无害化处理厂，统一实施无害化处理。3发酵饲料、粪便可在指定地点堆积，密封彻底发酵，表面应进行消毒。4无害化处理应符合环保要求，所涉及到的运输、装卸等环节应避免洒漏，运输装卸工具要彻底消毒。附件11高致病性禽流感流行病学调查规1 围本标准规定了发生高致病性禽流感疫情后开展的流行病学调查技术要求。本标准适用于高致病性禽流感暴发后的最初调查、现地调查和追踪调查。2 规性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单位（不包括勘误的容）或修订版均不适用于本标准。鼓励根据本标准达成协议的各方研究可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY 764 高致病性禽流感疫情判定及扑灭技术规NY/T 768 高致病性禽流感人员防护技术规3 术语和定义3.1 最初调查兽医技术人员在接到养禽场/户怀疑发生高致病性禽流感的报告后，对所报告的养禽