益生菌耐受性对喷雾干燥后菌体活性的影响研究

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1、目 录摘 要- 1 -Abstract- 2 -第一章 前言- 3 -1.1 益生菌- 3 -1.1.1 益生菌的概念和常见益生菌的分类- 3 -1.1.2 益生菌的作用- 3 -1.1.3 人体内的乳酸杆菌- 4 -1.2 喷雾干燥法制取活性益生菌干粉- 4 -1.2.1 活性益生菌干粉- 4 -1.2.2 喷雾干燥技术- 4 -第二章 材料与方法- 6 -2.1 材料- 6 -2.2 实验方法- 7 -2.2.1 实验所用溶液- 7 -2.2.2 温度曲线的测定- 7 -2.2.4 菌种的转接- 7 -2.2.5 菌种的活化- 7 -2.2.6 扩大菌含量进行培养- 8 -2.2.7 收集

2、菌液- 8 -2.2.8 热处理- 8 -2.2.9 革兰氏染色法- 8 -2.2.9 喷雾干燥- 9 -2.3 测定方法- 9 -2.3.1 稀释涂布平板法- 9 -2.3.2 存活率计算- 10 -第三章 结果与讨论- 11 -3.2 温度曲线的测定- 12 -3.3 LGG与LCBL23在RSM培养基中的生长状况- 13 -3.4 LGG与LCBL23在RSM培养基中不同生长条件下的菌活- 14 -3.5 LGG与LCBL23在RSM培养基中不同生长条件下的热处理存活率- 15 -3.6 喷雾干燥- 16 -第四章 结论- 17 -参考文献- 18 -致谢- 19 -摘 要本课题采用鼠李

3、糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）和干酪乳杆菌BL23（Lactobacillus casei BL23，LCBL23）作为模型菌株，研究不同的生长环境对益生菌耐受性的影响，并通过热处理对益生菌耐受性进行测量，以期设计一个良好的生长环境可以有效地提高喷雾干燥中益生菌的耐受性用以提高益生菌的存活率。我们选用了在喷雾干燥过程中拥有良好保护性的载体复溶脱脂奶（RSM）和葡萄糖溶液作为生长培养基，对比了LGG菌株和LCBL23菌株在RSM培养基中不同生长条件下的生长状况和60 oC水浴中热处理不同时间后的菌活，以了解RSM培养基在不同的生长条件下对益生菌耐受性

4、的影响。在不同生长条件下的RSM培养基中的LGG和LCBL23的菌活的初始水平基本保持在108 cfu/mL，60 oC热处理3 min后出现了活性的快速降低。在热处理的后期，RSM菌液的温度快速升高，在42 oC有氧条件下培养的LGG菌株表现出了相较于其他培养条件更好的耐受性，使用其他培养条件的菌体相较于42 oC有氧条件下培养的死亡率更高，可能是较严峻的生长条件增强了菌株的耐受性，而LCBL23同样在42 oC有氧条件下拥有了较其他生长条件更好的耐受性，笔者认为出现这样的情况同样是因为相对严峻的生长条件增强了LCBL23菌株的耐受性。本论文采用热处理和喷雾干燥的方法探究益生菌耐受性对喷雾干

5、燥后菌体活性的影响。对比不同生长条件下益生菌耐受性对热处理后菌体活性的影响，得到用于喷雾干燥的益生菌的最佳生长条件，以期提高益生菌的耐受性，从而提高喷雾干燥益生菌粉末的产量。关键词：益生菌；喷雾干燥；热处理；细胞活性；生长条件作者：胡寅轩导师：傅楠 - 19 -AbstractIn this study, different growth conditions were employed to culture model microorganisms of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and Lactobacillus casei BL23 (LCBL23

6、), to study the effect of growth environment on the stress tolerance of probiotic cells, and to measure the probiotic tolerance during heat treatment. The objective was to design a good growth condition that can effectively improve the tolerance of probiotics in spray drying, which results in the ma

7、ximum survival of probiotics. Reconstituted skim milk (RSM) supplemented with glucose, which showed excellent protection during spray drying process, was used as growth medium. The growth profiles of LGG and LCBL23 cultured under different conditions were compared. The viability of the two strains a

8、fter heat treatment at 60 oC in a water bath was used to understand the effect of different growth conditions. The initial viability of LGG and LCBL23 in RSM/Glu medium under all growth conditions was maintained at 108 cfu/mL, and the viability declined rapidly after 3 min at 60 oC. At the later sta

9、ge of heat treatment, the temperature of the cell culture rapidly increased, and the LGG strain cultured under aerobic conditions at 42 oC showed better tolerability than the cells under other culture conditions. When LGG culture obtained at other culture conditions was used, the mortality than the

10、culture at 42 oC aerobic condition, which may indicate that the adverse growth conditions at 42 oC aerobic condition could enhance strain tolerance. Similarly, LCBL23 also showed higher tolerance when cultured under 42 oC aerobic condition. In this thesis, heat treatment and spray drying methods wer

11、e used to explore the effect of probiotic tolerance on the viability of bacteria. Comparing the effects of probiotic tolerance under different growth conditions on the viability of bacterial cells after heat treatment, the best growth conditions for probiotics for spray drying were determined as 42

12、oC aerobic condition, which can effectively increase the tolerance of probiotics and thus increase the survival of probiotics after spray drying.Keywords: probiotics, spray drying; heat treatment; cell viability; growth conditionWritten by:Yinxuan HuSupervised by:Nan Fu第一章 前言1.1 益生菌1.1.1 益生菌的概念和常见益生

13、菌的分类益生菌(probiotics)，又称为益生素、活性菌、促生素、微生态制剂，是一类可以平衡并维持人体内菌群，同时可以对人体的健康产生一定有益作用的活菌产品或者含有菌体代谢产物及菌体组分一些的死菌产品1。益生菌（probiotics）这一单词最早源自于希腊文，它的意思是：对生命有益的一类微生物。目前常见的乳酸菌来自于九个属：乳酸乳球菌属、链球菌属、明串珠菌属、迷走球菌属、片球菌属、乳酸菌属、双歧杆菌属、肉食杆菌属和孢子乳酸菌属。前五个属为球状细菌，后四个属为杆状细菌2。1.1.2 益生菌的作用1903年，诺贝尔奖获得者著名的俄国生物学家梅契尼柯夫（Elie Metchnikoff）开始研究

14、衰老与长寿的关系并提出了“乳酸菌长寿说”。他发现在他进行研究的很多国家和地区中，保加利亚地区居住的百岁老人的数量十分可观。梅契尼柯夫对这一发现非常感兴趣，于是他开始研究其中的原因，发现当地人几乎每天都饮用酸奶，因此梅契尼柯夫认为保加利亚地区百岁老人的健康和长寿的原因是当地广泛食用的保加利亚酸奶中的微生物，所以他将酸奶中的微生物命名为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus Bulgaricus）。梅契尼柯夫认为酸奶中含有大量的益生菌，可以进入人的体内，改变肠道菌群并抑制对健康不利的细菌的生长，从而减少肠道内有害菌产生的毒素，造就了保加利亚地区居民的长寿。如今，很多人都在使用以益生菌为主要原料

15、的食品或药品进行自我保健，这是一种利用乳酸菌、双歧乳酸杆菌等益生菌作为主进行疾病的预防或保健的新型自我保健方法。益生菌可以通过很多类型的发酵乳制品或者其他种类食品进入人体调整肠道的微生态平衡，也可以作为药品治疗一些肠道疾病。1.1.3 人体内的乳酸杆菌乳酸杆菌是人体肠道正常菌群重要的一类菌种，它们定植于人体肠道中，具有较强的耐酸性。目前发现在人体肠道环境中常见的乳菌杆菌有如下种类：嗜酸乳杆菌群、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、布氏乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等3。但存在于人体肠道内的所有乳酸杆菌因为科学技术水平的原因尚不能全部鉴定分离，迄今为止我们发现的乳

16、酸菌有18个属152种4。1.2 喷雾干燥法制取活性益生菌干粉1.2.1 活性益生菌干粉活性益生菌干粉有利于储存产品和易于运输，同时可以在一定程度上满足日益增长的市场需求，具有活性的益生菌干粉具有巨大的商业价值。相较于益生菌的液体产品而言，益生菌干粉具有菌种的活性保存时间更长、物流成本相对低廉、质量更容易控制同时方便被进一步加工等诸多优点。1.2.2 喷雾干燥技术喷雾干燥现代食品工业中应用十分的悠久和广泛的一种干燥方法，具有制粉快速和产量大的有点，是目前工业上应用最为广泛的干燥手段5。具有活性的益生菌粉末在食品行业中有着十分重要的地位和可观的商业价值。目前活性益生菌粉末的加工技术有喷雾干燥技术

17、、冷冻干燥技术和包埋技术。与冷冻干燥技术相比，喷雾干燥技术的设备便于操作、制粉成本低廉、制粉迅速且产量高。喷雾干燥的过程是首先将进料液雾化成很多细小的液滴，然后在喷雾塔中与热空气充分混合使料液的溶剂蒸发，最后变成干燥的颗粒通过旋风进行分离或经过自然沉降后被收集出塔。喷雾干燥技术的优点主要有6：第一，快速高效的制粉；第二，喷雾干燥可以用于加工热敏性材料；第三，喷雾干燥可以单步骤地生产分散颗粒与微胶囊；第四是喷雾干燥可以用于工业中大规模连续化生产。因此工业制取益生菌粉末大部分都在采用喷雾干燥的生产方法7。但益生菌在喷雾干燥过程中会收到诸多其他因素的影响，例如：1.菌体自身耐受性； 2.干燥过程中的

18、载体选择；3.干燥条件。所以，想要得到具有良好活性的益生菌粉需要改善喷雾干燥过程中的不利环境因素同时通过预处理提高菌体的耐受性，从而减少喷雾干燥过程中的菌活损失。因此，在喷雾干燥的实际生产中，由于我国乳酸菌饮料卫生标准规定为每毫升或每克至少含有益生菌活菌数为106 cfu/mL8，因此生产者会综合利用各种条件和方法以获得最大菌活。第二章 材料与方法2.1 材料实验所用仪器及药品如表格所示。表 1. 主要仪器主要仪器厂家生物安全柜上海力康 HFsafe-1200LC摇床希尔科（Thermo）SHKE6000-8CE水浴锅精宏XMTE-8112红外灯安胜（Essenscien）培养箱日本三洋（SA

19、NYO）电子天平梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）T型热电偶美国Pico扫描电子显微镜日本日立 S-4700表 2. 药品药品厂家琼脂粉索莱宝（Solarbio）蛋白胨粉末索莱宝（Solarbio）M.R.S培养基Oxoid葡萄糖粉末上海沪试实验室器材股份有限公司复溶脱脂奶（RSM）澳大利亚德运（Devondale）菌种：鼠李糖乳杆菌（LGG）、干酪乳杆菌 BL23(LCBL23) 在本实验中RSM培养基均在 110 oC下灭菌 10 min后进行使用，实验用玻璃器及其他容器和溶液则在 121 oC下灭菌15 min后冷却到室温使用。2.2 实验方法2.2.1 实验所用溶液5.2

20、% （w/w）MRS液体培养基、MRS 固体培养基（含1.2 % （w/w）琼脂粉和5.2 % （w/w）M.R.S）、蛋白胨（0.5 % w/w）、R.S.M培养基：3.2 % （w/w） 复溶脱脂奶（RSM） + 2 % （w/w） 葡萄糖，所有溶液的配制使用超纯水（水的电阻大约等于18 M，来自Milli-Q 超纯水系统）。2.2.2 温度曲线的测定将LGG和LCBL23菌种活化后按1 % （v/v）的接种量接种于总固体含量为5.2 %的RSM培养基中37 oC（或42 oC）恒温培养24 h后，混匀后取出1 ml菌液，置于2 ml离心管中，后放置于60 oC水浴锅中，使用热电偶进行温度

21、测量，根据温度数据以时间为横坐标，以温度为纵坐标绘制温度曲线。2.2.4 菌种的转接从保存菌种的冰箱中取出一个接种完成的平板划线培养基，在无菌环境下用接种环挑取单菌落，在灭菌过的固体M.R.S培养基上进行划线操作，37 oC恒温培养48 h后取出保存。每周进行一次划线转接操作，以保证菌种活性。2.2.5 菌种的活化从冰箱中取出划线平板在无菌操作环境下用接种环挑取1 个单菌落接入已经灭菌的10 ml液体MRS培养基中，在37 oC恒温培养12 h进行活化。按照上述步骤活化2瓶菌液以备用。2.2.6 扩大菌含量进行培养将活化完成的菌液以1 % （v/v）的接种量接入总固体含量为5.2 %的RSM培

22、养基，不同的生长条件下恒温培养24 h，生长条件分别为：1.厌氧条件下37 oC恒温培养24 h；2.在20 rpm的条件下37 oC恒温培养24 h；3.厌氧条件下42 oC恒温培养24 h；4. 20 rpm的条件下42 oC恒温培养24 h。2.2.7 收集菌液将培养后的菌液在无菌环境下混匀后取出1 ml菌液置于2 ml离心管中。按照此步骤取样若干瓶菌液以备用。2.2.8 热处理将收集好的菌液置于离心管中后，分别置于60 oC水浴锅中恒温热处理2 min、4 min、6 min、8 min、10 min后使用稀释涂布平板法进行菌落计数并与0 s时涂布所得到的菌活进行比较，得到不同生长环境

23、中所得到的菌液经热处理后的存活率。2.2.9 革兰氏染色法1制片将待检验的菌制作涂片，待干燥后固定，固定时通过酒精灯火焰一至二次。2染色（1）初染：将结晶紫滴加到载玻片上约一分钟，然后用清水洗净；（2）媒染：滴加碘液到载玻片上保持覆盖约一分钟，用清水洗涤；（3）脱色：将载玻片上面的水清理干净，使用酒精清洗至流出的酒精不再出现紫色时为止，之后立即用清水冲洗干净；（4）复染：将番红液覆盖至载玻片上染一至二分钟，用清水洗净；（5）镜检：待载玻片干燥后，置于油镜下观察。2.2.9 喷雾干燥在实验室规模的新型微流体喷雾塔（MFJSD）上进行喷雾干燥实验。以30% （w/w）RSM作为保护性载体，将37

24、oC MRS液体培养基中培养得到的菌液与42 oC MRS液体培养得到菌液与42 oC RSM培养基中培养所得到的菌进行喷雾干燥。其中，进口空气温度分别控制在82 oC、97 oC、82 oC，出口空气温度分别在55 oC、58 oC、61 oC。将得到的粉末稀释，并在MRS固体培养基上进行涂板，然后置于37 oC恒温培养48 h，计算菌活。2.3 测定方法2.3.1 稀释涂布平板法制备菌液稀释液：混匀菌液后在无菌环境下使用移液枪取出菌液0.5 mL，放入装有4.5 mL灭菌过的蛋白胨溶液小瓶中，混匀，使细胞分散开，即为稀释了101的菌液；然后再使用移液枪取出1 mL 101稀释液，转移到装有

25、9 mL无菌蛋白胨溶液中，混匀，得到稀释倍数为102的稀释液；重复此步骤进行连续稀释，制成稀释度为104、105、106等浓度的菌液。涂布平板：取100 L菌液，在标记好稀释度的无菌MRS固体培养基上使用一次性无菌涂棒进行涂板操作。将完成涂板的培养基置于37 oC恒温环境中培养48 h后进行计数。计算方法：1 mL菌液中的菌含量N（cfu/mL） = 菌落数 x 稀释倍数 x 10 （1）2.3.2 存活率计算细胞热处理后存活率（%） = 热处理后的菌活N / 初始菌活N0 x 100 （2）第三章 结果与讨论3.1 革兰氏染色的结果将所用的LGG与LCBL23菌种进行革兰氏染色，将染色后的菌

26、置于光学显微镜下观察。得到的光学显微图像如图 1。可以看出，LGG与LCBL23为典型的革兰氏阳性菌在显微镜下呈紫色，同时在光学显微镜下呈现出了杆菌的特点，实验过程中LGG与LCBL23均未遭受严重的污染，在显微镜下未观察到杂菌。a b 图1 革兰氏染色图。（a）鼠李糖乳杆菌（LGG）；（b）干酪乳杆菌（LCBL23）。3.2 温度曲线的测定 以时间为横坐标，温度为纵坐标绘制温度曲线。图 2（a）展现的是鼠李糖乳杆菌LGG在总固体含量为5.2 %的RSM培养基培养24 h后取1 mL菌液在60 oC水浴锅中的进行水浴加热时的温度曲线；图 2（b）展现的是干酪乳杆菌 BL23在总固体含量为5.2

27、 %的RSM培养基培养24 h后取1 mL菌液在60 oC水浴锅中的进行水浴加热时的温度曲线。其中LGG菌液达到60 oC需要141 s，LCBL23达到60 oC需要148 s，两种菌液加热至60 oC的时间相差不大。a b图 2 热处理过程中菌液温度变化曲线。热处理条件：60 oC，（a）LGG和（b）LCBL23在3.2 % RSM +2%葡萄糖中培养24 h后的菌液1 mL。.3.3 LGG与LCBL23在RSM培养基中的生长状况很多研究者在益生菌的喷雾干燥实验中选用RSM作为保护载体9-10。为了保证菌种在RSM载体中的存活率，本实验采用总固体含量为5.2 %（w/w）的RSM液体作

28、为培养基。其中3.2 %的RSM和2 %的葡萄糖为菌种提供了足量的氮源和能量。在RSM培养基中，LGG和LCBL23菌种均可以利用其营养成分发酵。LGG在RSM培养基中培养24 h后可以得到具有清晰分层现象的奶酪状固体，其中上半层为澄清液体， 下半层为白色不透明奶酪状固体。LCBL23在RSM培养基中培养24 h后发酵产物依然为白色不透明液体，与培养前的无菌RSM培养基具有相似的性状。LCBL23和LGG在总固体含量为5.2 %RSM培养基中在不同生长条件下培养24 h后所得到的初始菌活如图 3所示。从图 3中可知，LCBL23与LGG在总固体含量为5.2 %的RSM培养基中初始菌活基本保持在

29、108 cfu/mL，而在20 rpm条件下培养的LCBL23菌种的初始菌活保持在107 cfu/mL。相比较发现，LGG在总固体含量为5.2 %（w/w）的RSM液体培养基中的初始菌活比LCBL23更高，说明LGG相较于LCBL23有着更好的环境耐受性。图 3.LGG与LCBL23在3.2 % RSM +2%葡萄糖中培养24 h后的初始菌活3.4 LGG与LCBL23在RSM培养基中不同生长条件下的菌活将LGG在RSM培养基中培养24 h后的菌液收集并进行热处理不同的时长，然后采用稀释涂布平板法在MRS固体培养基上进行再生长涂板，并放置在37 oC培养箱中恒温培养48 h后取出进行菌落计数并

30、按照1 mL中含菌量=菌落数x稀释倍数x10进行菌落计算，按照相同的步骤处理LCBL23并进行计算。LGG热处理不同时长后的菌活如图 4所示，LCBL23热处理不同的时长的菌活如图 5所示。从图中的数据发现，LGG相较于LCBL23有更强的耐受性，在热处理相同的时长后，LGG的菌活更高，证明LGG相较于LCBL23耐受性更好。图 4. LGG热处理不同时长后的菌活 图 5. LCBL23热处理不同的时长的菌活3.5 LGG与LCBL23在RSM培养基中不同生长条件下的热处理存活率将热处理不同时间后的LGG于LCBL23得到的菌活按照细胞热处理后按照存活率的公式（公式2）进行计算，并将不同的生长

31、环境下生长的菌的热处理存活率按热处理时间制图，如图 67所示。从图中发现，LCBL23与LGG均在42 oC，20 rpm的条件下获相较于其他生长条件更高的存活率。我认为是有氧条件略微增强了菌种的耐受性，从而提高了热处理后菌种的存活率，同时，42 oC相较于最适生长温度（37 oC）更高，因此更高的生长温度可能也在一定程度上提高了LGG与LCBL23的耐受性，使得菌种经过热处理后的菌活得到了提高。 图 6. 不同的生长环境下LGG的热处理存活率图 7. 不同的生长环境下LCBL23的热处理存活率 图 8.不同生长条件下培养的LGG喷雾干燥后存活率3.6 喷雾干燥将37 oC MRS液体培养基中

32、培养得到的LGG菌液、42 oC MRS液体培养得到的LGG菌液与42 oC RSM培养基中培养得到LGG菌液以30 %的RSM作为载体进行喷雾干燥后进行再生长涂板得到的菌存活率如图 8所示。可以发现在在30 %的RSM载体中进行喷雾干燥的菌经过42 oC生长环境的存活率明显高于在37 oC环境中培养的菌，其中以在RSM培养基中培养的菌喷雾干燥后存活率最高，高达216.14 %。由于时间原因，无法再进行重复实验。但从已有的数据中可以看出在较为苛刻的生长温度条件下LGG的耐受性得到了提高，同时在RSM液体培养基中培养的LGG喷雾干燥后存活率极高。可能是RSM中的某些成分具有一定的保护性或修复性，

33、也可能是RSM载体中培养的LGG的耐受性得到了更大的提高。第四章 结论本研究采用了一种RSM培养基同时通过改变不同的生长环境对LGG和LCBL23菌种进行预处理，以期提高菌种在喷雾干燥后的菌体活性。由于在很多喷雾干燥采取的出口温度一般为60 oC，故本实验采用60 oC进行热处理，以期对真实的喷雾干燥条件进行模拟。同时依据热处理后所得到的菌活对LGG和LCBL23用于喷雾干燥的最适生长条件进行摸索判断，希望可以通过改变菌种的生长环境以提高耐受性，从而提高喷雾干燥后的菌体活性。在后期的喷雾干燥实验中，我们选用了37 oCM.R.S液体培养基中培养得到的LGG菌液与42 oCM.R.S液体培养得到

34、的LGG菌液与42 oCRSM培养基中培养得到LGG菌液在包埋30 %的RSM载体中进行喷雾干燥。结果表明，在42 oC和20 rpm条件下培养出来的LGG及LCBL23具有相对于其他生长环境更好的耐受性。同时在42 oCRSM中培养出的LGG表现出了极高的喷雾干燥存活率。这项工作为益生菌喷雾干燥实际运用的生长条件开发开辟了新的途径，可以确保在培养的过程中菌耐受性方面有所提高。这也将让益生菌粉末更加可持续更加节能的生产，因为喷雾干燥的能量消耗远低于目前使用的冷冻干燥。参考文献1 吴克刚,柴向华. 食品徽胶囊技术M. 北京:中国轻工业出版社. 20062 杨汝德,陈琼,陈惠音. 乳酸菌发酵制品研

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