植物组织培养技术考试要点

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1、 名词解释植物组织培养：是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等的培养基中，使其生长、分化，形成完整植株的过程。培养基：是离体植物（外植体）赖以生长、分化的基础，是根据植物的需求，人工配制的含有各种营养成分的营养液。污染：在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。褐变：在组培过程中，由培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢而死亡的现象。玻璃化：当植物材料进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会出现半透明状和水渍状，这种现象称为玻璃化。脱分化：已有特定结构与功能的植物组织，在一定的条件

2、下，细胞改变原来的分化状态，失去原来的结构和功能，转变为具有分生能力的细胞，这个过程称为脱分化。再分化：在愈伤组织生长到一定阶段后即可通过更换培养基或改变培养条件，诱导促使其中的“芽点”或“原始胚状体”逐渐发育成一个幼小的植物体，这一过程就叫做再分化。愈伤组织：植物各种器官的外植体在离体的条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为分化细胞，继而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，称为愈伤组织。驯化：开始继代培养要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长，这种现象称为“驯化”。种质：亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。植物种质保存：利用天然或人工创造的适

3、宜环境，使个体中含有的遗传物质保持其遗传完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。常温保存：在常温（205）OC条件下，通过改变培养基中某些营养物质的浓度，改变培养的环境条件，可达到种质保存的目的。低温保存：低温保存也称为缓慢生长保存，是通过改变培养基和环境条件使培养基的生长降到最低限度，又不致死亡，以达到延长保存时间的目的。超低温保存：也称为冷冻保存，主要是指在液氮的超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜的条件下细胞可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。1、 简述植物组织培养技术的主要特点。（1） 基础理论 植物组培的基础理论是植物细胞全能性的理论，即每个细

4、胞都拥有该物种的所有遗传信息，并在条件适合的情况下能够发挥该物种的各种功能和具有发育成为一个正常和完整的独立个体的能力。（2） 技术特点 无菌培养和外植体培养（3） 生产特点 不占用耕地，生产不受季节控制 周年连续生产，不受灾害天气和病虫害限制 生长环境可人工控制并人为创造2、 植物组培的意义和作用主要有哪些？（1） 培育新品种的有效手段（2） 种质资源保存的有效方法（3） 去除病毒、真菌和细菌等病害和无性系的快速繁殖（4） 促进有机物的生产和生理学的研究3、 简述通用实验室的构成和用途。 此区包括药品储存室、洗涤室、培养基配制室和灭菌室等。（一） 药品储存室 药品储存室主要存放组织培养常用的

5、各种化学试剂，如无机盐、有机物、生长调节剂、消毒剂及各种生化试剂等。（二） 洗涤室 洗涤室用于清洗各种培养器皿、用具及培养材料等。（三） 培养基配制室 培养基配制室用于培养基的配制、分装、封口，以及培养基灭菌前暂时存放。（四） 灭菌室 灭菌室用于培养基、器皿、工具的灭菌消毒工作。4、 接种室包括哪些设备和用具？ 接种室又称无菌室，是进行菌种分离和接种的专用房间，室内安装一空调，使室温可控，接种室外面设缓冲间门不宜对开，最好安装滑动门窗，接种室内的地面和墙壁要求光滑洁净，室内根据要求配置一定数量的超净工作台、接种用的小推车以及接种工具和消毒用的乙醇、酒精灯等，室内和缓冲间装紫外线灯和日光灯。5、

6、 培养设备是什么，主要包括哪些？培养设备是指专为培养物创造适宜的光、温、水、气等条件的设备，包括：空调器、定时器、恒温器、增湿机或去湿机、培养架、摇床或旋转床、光照培养箱、照度计及温、湿度计。6、 简述一个标准组培实验室应具备设施。（1）玻璃器皿和其他实验器皿的清洗和储存（2）培养基的制备、灭菌和存放（3）植物材料的无菌操作（4）将接种材料培养在适宜的温度、湿度和光照条件下（5）培养材料的细胞学及解剖学观察、实体照相、切片观察7、 玻璃器皿的清洗的总体要求、标准和不同玻璃器皿的清洗方法。(1)总体要求：有机物、油脂等污物去掉（2）标准：瓶壁透明发亮，内外碧水膜均一，不形成水珠（3）不同器皿的清

7、洗 新器皿1%稀HCl浸泡12h，再用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗1遍，晾干后备用 用过器皿 先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用温肥皂水或洗洁精洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1次，晾干后备用 污染器皿 在121OC高温蒸汽灭菌30min后，倒去残渣，用清水冲洗，蒸馏水，晒干，有菌斑用毛刷刷净，再用清水冲洗干净，浸泡于浓的重铬酸钾洗涤液中，浸泡2小时，清水冲洗后用蒸馏水洗，晾干8、 组织培养工厂有哪些厂房和场地组成？各自的功能和作用是什么？组培育苗工厂一般划分为以下几个生产车间：培养瓶清洗车间、培养基母液调配车间、培养基制备车间、无菌操作车间、培养车间、炼苗温室和苗圃。（1）

8、 培养瓶清洗车间 可承担大量的培养器皿如三角瓶、试管、培养皿等的洗涤与试管苗出瓶工作。（2） 培养基母液调配车间 已知的培养基组成成分不下10种，为了减少工作量，提高工作效率，在配制培养基时，一般先配成比所需浓度高10100倍的母液，配制使用时可按比例稀释。（3） 培养基制备车间 完成培养基配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。（4） 无菌操作车间 也称接种车间，是组培工厂最核心和关键部分。（5） 培养车间 将接种的材料在人为控制温度、湿度和光照等条件下进行培养生长的场所。（6） 炼苗温室和苗圃 炼苗温室 创造适宜温度条件 苗圃 直接向社会提供各种良种壮苗，可根据市场信息、林业生产等需要灵活安排各

9、种林业苗木、观赏花卉等的育苗计划。9、 组织培养工厂有哪些主要设备？这些设备各有什么作用？（1）超净工作台 是一种提供局部无尘无菌工作环境的单向流型空气净化设备。（2）高压蒸汽灭菌锅 最基本的灭菌装备，用于培养基的灭菌。（3）培养架 摆放大量培养物，以利于大量生产的需要。（4）照明光源 补充植物光合作用的需要。10、 培养基的成分主要有哪些？主要包括5大类：无机养分、有机养分、植物生长调节物质、糖（碳源）以及介质或载体（纸桥或琼脂等），此外还含有大量的水分，可提供植物所需的碳、氢、氧，配制培养基时一般用离子交换水、蒸馏水或重蒸馏水。11、 什么是外植体？如何进行外植体的选择？外植体是指第一次接

10、种用的植物材料。（1） 选择合适的部位 木本植物、较大的草本植物采取茎段，本身矮小或缺乏显著的茎的草本植物采用叶片、叶柄、花葶或花瓣等作外植体，满天星、勿忘我、情人草和菊花等都是带芽的材料作为外植体。（2） 取材季节合理 多年生植物生长期取材，特别是春芽 一年生植物幼嫩组织（3） 考虑器官的生理状态和发育年龄 幼嫩年龄的组织器官更适于组培（4） 选择合适大小的外植体 0.51cm（5） 选择健壮的植株 （6） 选择优良的种质 （7） 选择合适的植物种类 双子叶单子叶、草本木本12、 外植体的接种主要有哪些技术步骤？（1） 在接种前4h用甲醛熏蒸接种室，并打开室内紫外灯进行灭菌。（2） 在接种前

11、20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯。（3） 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等。（4） 上工作台后，用乙醇棉球擦拭双手，特别是指甲处，然后擦拭工作台面。（5） 先用乙醇棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干。（6） 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等。（7） 接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。若连续接种，每5天要大强度灭菌1次。13、 简述培养基配制的主要技术步骤。将已配种好的各种母液按顺序排好，根据母液倍数或浓度计算和吸收相应量的各种母液和生长调节物质；计算和称取琼脂

12、和蔗糖。由于琼脂较难溶解，所以先在烧杯或量杯中放入一定量的水，加入琼脂，在电炉上加热并不断搅拌，使之溶解。按照大量元素、微量元素、铁盐、有机物和生长调节物质母液的顺序倒入已融化的琼脂中，继续加温，不断搅拌，使之均匀溶解。若母液在贮藏过程中产生沉淀或结晶，或是变色，则不能使用，应重新配制。加入蔗糖，待蔗糖溶解后，加水定容至所需体积。调整培养基的pH。大多数的园林植物都要求在pH5.65.8的条件下进行组织培养。一般用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调节。培养基的分装：一般占培养容器的1/41/3为宜。14、 外植体为什么褐变？如何防止其褐变？（1） 原因 由于外植体中的酚类化合物与多

13、酚氧化酶作用被氧化形成褐色的醌类化合物，醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。（2） 措施 正确选择外植体 选择适宜的培养基 创造合适的培养条件 连续转移15、 配制母液的原则。（1） 相同类型试剂混合（2） 容易形成沉淀的药剂要分开（3） 母液浓度适宜（4） 用量认真计算核对（5） 药品准确称量16、 用于外植体灭菌的常用药剂有哪些？各自特点如何？最常用的是次氯酸钠，所需的灭菌时间稍长，但性质比较温和，对植物材料杀伤较轻，比较灭菌的材料经常用它，但灭菌的彻底程度不如氯化汞，使用质量浓度2%，灭菌时间5

14、30min。氯化汞相对灭菌效果最好，但必须较严格地掌握灭菌时间，并需多次无菌水冲洗才能洗脱表面附着的残液，否则植物材料易产生毒害或受到强烈抑制，使用质量浓度0.11%，灭菌时间530min。乙醇 使用体积分数7075%，灭菌时间0.22min。17、 各种植物组织器官的灭菌方法。外植体消毒程序备注前处理消毒冲洗茎段自来水冲洗后，70%乙醇中浸泡数秒2%次氯酸钠溶液中浸泡1530min无菌水冲洗34次以茎段或顶芽为外植体叶片自来水冲洗后，70%乙醇中浸泡数秒0.1%氯化汞溶液中浸泡1min，再在2%次氯酸钠溶液中浸泡1530min无菌水反复冲洗，吸干过多的水分以叶片或叶柄切段为外植体器官自来水冲

15、洗后，70%乙醇中浸泡数秒2%次氯酸钠溶液中浸泡2030min无菌水冲洗34次，无菌滤纸吸干水分以芽眼或内部器官为外植体果实70%乙醇中浸泡数秒2%次氯酸钠溶液中浸泡10min无菌水冲洗34次培养幼胚获得植株或取果肉为外植体种子70%乙醇中浸泡数分钟，无菌水冲洗10%次氯酸钙浸泡2030min，再用1%的溴水浸泡5min无菌水冲洗34次，无菌滤纸吸干水分以萌芽的幼苗各部位为外植体18、 组培中污染原因有哪些？如何预防？（1） 微生物细菌感染 材料带菌或培养基灭菌不彻底 操作人员不慎 工作人员使用了未经充分灭菌的工具及呼吸时呼出的细菌，或手接触材料或器皿边缘，使微生物落入材料或器皿 器械环境 周

16、围环境不清洁或空气不洁净，灰尘很多，或超净工作台的过滤装置失效，培养用器皿口径过大，瓶口边缘污染真菌（2） 防止材料带菌 外植体灭菌 玻璃器皿的灭菌 金属器械灭菌 布质制品灭菌 操作室培养室 操作人员严格按照无菌操作规范操作19、 玻璃化的原因及预防措施。（1） 激素浓度 高浓度的细胞分裂素有利于促进芽的分化，也会使玻璃化的发生比例提高 温度 高温或温度变化幅度大会提高玻璃化的发生率 湿度 高湿条件使玻璃化发生频率升高 琼脂浓度 随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗的比例减少 光照强度 增加光照强度使玻璃化发生比例降低 培养基成分 提高培养基的碳氮比，可以减少玻璃化的比例 （2） 调整培养基中无机成分

17、 提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度 降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制温度 改善培养容器的气体交换状况20、 组培苗的特点，愈伤组织再生形成新植物体途径。（1） 组培苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达，气孔的调节能力差。 组培苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿素的光合作用较差。 根的吸收能力极低，根系吸收的水分难以满足小苗蒸腾作用的消耗，小苗体内的水分达不到平衡。 组织幼嫩，结构较松散，细胞含水率高，机械组织很不发达，容易发生机械损伤，对逆境的适应和抵抗能力差。（2） 愈伤组织不定芽植株 先芽后根 先根后芽 不同部分产生芽根 愈伤组织胚状体植株21、 哪些组织适合进行组培快速繁殖

18、？（1） 通过培养生产不带病毒的种苗，使生产力得到大幅度的提高，例如马铃薯、香蕉和大蒜等。（2） 有性繁殖时变异幅度大的品系，可以从这些群体中选择优良的个体，进行无性繁殖，生产出整齐划一的大量种苗，例如某些果树和兰花等。（3） 雌雄异株植物，通过组培快繁技术繁殖具有更高栽培价值的雌性植株或雄性植株。（4） 需要用较大量的目的产品作为种苗材料进行种植的物种，如大蒜、甘蔗等。（5） 组培快繁技术简单、繁殖系数高的植物，如杂种芹菜、胡萝卜等。（6） 在野生或传统的栽培条件下个体繁殖效率低下的植物，如兰花等。22、 组织培养有哪些途径可以实现繁殖植物种苗的目的？（1） 短枝发生型：微型扦插 特点：能一

19、次成苗，遗传稳定，成活率高，但繁殖系数低（2） 丛生芽发生型 特点：不经过愈伤阶段，后代变异小（3） 不定芽发生型 特点：繁殖系数高，但变异大（4） 胚状体发生型 特点：成苗量大，速度快，结构完整，但对其发育过程了解不足，应用不十分广泛（5） 原球茎发生型：兰科植物特有23、 组培快繁有哪些步骤？第一阶段：初代培养 第二阶段：芽苗的增殖 第三阶段：诱导芽苗生根 第四阶段：炼苗和移栽24、 组培快繁方式的优势？（1） 繁殖效率高，生长速度快（2） 组培快繁不受季节和环境条件限制（3） 培养条件的可控性强（4） 占用空间小，管理方便，有利于自动化管理（5） 不存在种子繁殖过程中的世代问题25、 影

20、响茎段组培快繁效果的因素及具体措施。（1）外植体材料的选取 选取生长健壮、无病虫和生长迅速的幼嫩茎段，优先选用顶部材料。（2）培养基中植物激素及其浓度 常用的细胞分裂素6-BA促进腋芽增殖，质量浓度0.55mg/L，常用的生长素NAA改善芽苗的生长状况，质量浓度0.051.0mg/L，赤霉素GA3质量浓度为1mg/L以下。（3）防止褐变和有害物质的积累 防止褐变措施：在培养基中单独添加或配合使用芸香苷，20%硫代硫酸钠溶液、柠檬、活性炭、维生素C及聚乙烯吡咯烷酮 pH为5.5是可以取得较好的培养效果 降低培养光照强度可以明显减轻外植体的褐变程度 发现外植体近旁培养基有褐变物质积累时马上转接到新

21、的培养基上（4）培养方式和条件 液体振荡培养增殖率高，缩短增殖周期，温度一般控制在2628OC之间你，光照时间为1216h/d，光照度在20003000lx之间26、 无病毒苗培育的意义？（1）无病毒苗培育可明显提高作物的产量、品质。（2）无病毒苗培育增产增收效益显著。（3）无病毒苗培育促进农产品出口，增加就业机会。（4）排除了使用药剂，降低生产成本，减少污染，防止公害，对保护环境有积极意义。27、 无病毒原因。（1） 在一个植物体内，病毒易于通过维管束系统而移动，分生组织则不存在维管束系统。（2） 病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝移动，速度缓慢，难以赶上茎尖分裂旺盛的分生细胞。（3

22、） 分裂旺盛的分生细胞代谢活性强，使病毒无法进行复制。（4） 植物体内存在病毒钝化系统，而茎尖分生组织内钝化系统活性最高，钝化病毒，使病毒难以复制。（5） 茎尖分生组织的生长素含量高，足以抑制病毒的增殖。28、 无病毒苗培育的方法有哪些？（1） 茎尖分生组织 （2）愈伤组织培养脱毒 （3）珠心胚培养脱毒（4）热处理脱毒 （5）微体嫁接脱毒 （6）热处理结合茎尖培养脱毒29、 茎尖培养脱毒的方法和过程。（1） 培育脱毒母株，获得外植体 选择品种 选择品质好，产量高，抗、耐病毒苗的品种 确保品种纯度 严格鉴定获取快繁外植体母株的品种纯度，可避免无效劳动，提高工作效率 获得外植体 选择生长健壮、无病

23、虫害的母株，既不受季节影响，又易消毒。（2） 选择培养基 常用的培养基有MS、N6、B5、Nitsch培养基等，诱导愈伤组织的培养基以添加2，4-D效果最好，其浓度为13mg/L，分化培养基中可根据其分化方向添加13mg/L的BA，再加少许的IAA（0.20.5mg/L），生根培养基可单独添加生长素（0.51mg/L）。（3） 剥离和接种 将处理好的植物部分，如包含茎尖的茎段或芽等灭菌，置超净工作台40倍显微镜下，剥去外叶和较大的叶原基，暴露出生长点分生组织，剥离带12个叶原基的分生组织，接种到试管内的芽分生培养基上。（4） 继代培养生根和快繁 将已接种外植体的试管置于（232）OC，光照度为

24、3000lx，光周期为1316h/d的培养室中培养23周成苗，待苗长至12cm高，转入生根培养基中培养，生长710d生根，转入快繁培养基继续繁殖。30、 无病毒植物鉴定方法有哪些？（植物病毒鉴定检测有几种方法？）（1） 目测症状法 （2）指示植物法 （3）血清学鉴定法 （4）电子显微镜鉴定法 （5）酶联免疫吸附法 （6）免疫吸附电镜法31、 花药培养和花粉培养有何区别和相同点？（1） 相同点：二者培养目的相同，都是为诱导花粉细胞发育成为单倍体细胞，形成单倍体植株。（2） 区别：花药培养为器官培养，花粉培养为细胞培养。32、 什么是单倍体育种及单倍体育种优势？以单倍体为材料的育种程序称为单倍体育

25、种。（1） 缩短育种年限 （2）单倍体育种的程序较简便33、 花药培养的大致过程如何？（1） 取材 （2）培养基的配制 （3）消毒 （4）接种 （5）培养34、 花粉植株发育有哪些途径？花粉细胞第一次有丝分裂 均等分裂两个等大子细胞，均匀诱导单倍体不均等分裂形成大营养细胞、小生殖细胞 a小细胞退化，大细胞均匀诱导单倍体 b大细胞退化，小细胞均匀诱导单倍体 c大小细胞均诱导单倍体35、 常用的单倍体植株二倍化有哪些途径？（1）自发加倍（自然加倍） （2）人工加倍 （3）从愈伤组织再生加倍植株36、 单细胞分离方法有哪些？（1）机械法 （2）酶解法37、 机械法、酶解法分离单细胞的具体过程如何？（

26、1） 机械法 称取10g新鲜叶片，进行表面消毒后放于研钵中。加入40ml研磨介质：20mol/L蔗糖+10mol/LMgCl2+20mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.8，轻轻研磨成匀浆。用两层细纱布过滤，取滤液。用低速离心法将滤液中细微的碎屑除掉，得到沉淀在底层的游离细胞。（2）酶解法 果胶酶的制备：0.5果胶酶+0.5葡聚糖硫酸钾+0.8甘露醇，配成20ml，调节pH为5.8，用孔径为0.20.4m的滤膜过滤灭菌。取刚长成的嫩叶用70乙醇漂洗数秒，用饱和漂白粉上清液浸泡15min，无菌水冲洗45次。吸干表面的水分，用消过毒的镊子撕去叶的下表皮。用消过毒的解剖刀将叶片切成3cm见方的小

27、块，取2g切好的叶片放入装有果胶酶液的三角瓶中。用真空泵抽气12min，使酶液渗入细胞间隙。将三角瓶置于低速转床上，转速为120r/min，温度2528OC，30min后，吸取酶液、碎片。 再放入上述果胶酶液20ml，保温振荡30min，吸出酶液，此酶液主要含有海绵组织细胞。再次放入上述果胶酶液20ml，保温振荡30min，用纱布或尼龙网过滤除去被消化的叶脉和表皮。在100g条件下离心2min，吸去上清液，底层即得均一的栅栏组织单细胞。38、 细胞悬浮培养的方法类型有哪两种？（1）分批培养 （2）连续培养39、 优良悬浮细胞培养体系的要求。（1） 愈伤化的细胞分散性良好（2） 细胞均一性好，细

28、胞有用成分含量高（3）增殖速度迅速40、 单细胞培养有哪些方法？各种方法的概念、用途、优缺点如何？看护培养法、微室培养法和平板培养法（1） 看护培养法 概念：是指把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上培养，促使单个细胞持续分裂和增殖的培养方法。 用途：诱导单细胞体系 优点：最大的优点是简便易行，且效果较好，易于成功。 缺点：不能在显微镜下直接观察细胞生长过程。（2） 微室培养法概念：是指把含有单细胞的培养液小滴放在无菌小室中培养，使单细胞生长和增殖形成单细胞无性系的无菌培养方法。用途：观察细胞的生长、分裂及形成细胞的过程优点：可对细胞培养过程进行连续显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化和形

29、成细胞团的全部过程。缺点：培养时间短。（3） 平板培养法概念：把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。用途：分离单细胞无性系，研究其生理生化、遗传上的差异，广泛应用于原生质体及细胞融合产物的培养。优点：可定点观察细胞，分离单细胞系容易。 缺点：培养细胞气体交换不畅。41、 什么是离体保存？离体保存有哪些优点？将组织和细胞培养中的外植体或试管苗储存在使其抑制生长、缓慢生长或无生长的条件下，达到长期保存的方法称为离体保存。 （1）解决一些无性繁殖作物种质资源在低温下长期保存问题，可有效避免资源的丢失。（2）节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少且能在保存中脱毒。（

30、3）在提供利用时，可快速繁殖，也有利于国际国内种质交换。42、 离体保存通常有哪几种方法？常温保存、低温保存和超低温保存。43、 植物组培材料的超低温冷冻保存的过程大致可分为几个阶段？各有什么特点？（1） 冷冻 尽量保持细胞和组织的自然状态，同时又能迅速停止各种酶的活动和细胞的各种生命活动。（2） 储存 温度不能超过-130OC，否则细胞内的冰晶就会生长，细胞生活力会因此而下降。（3） 解冻 要保持材料的生活力，自液氮中取出后，先投入温水溶液中。（4） 重新培养 解冻后的植物材料在培养前除去防腐剂，防止冷冻防腐毒害植物细胞44、 冷冻方法有哪几种？（1）快速冷冻法 （2）慢速冷冻法 （3）分步冷冻法45、 细胞的生活力和存活率的测定。（1）再培养，即化冻后立即将材料转移到新鲜培养基上进行再培养。（2）荧光素双醋酸酯染色法，与观察原生质体活力的方法一样。（3）TTC法，此法显示细胞内脱氢酶的活性。46、 冷冻保护剂分为哪两种类型？常见的冷冻保护剂有哪些？渗透型抗冻剂和非渗透型抗冻剂。渗透型抗冻剂:二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺、丙二醇和甘油等。非渗透型抗冻剂:聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖和聚乙二醇等。