细胞增殖-毒性实验步骤CCK
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1、细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤:实验准备:用75%酒精擦生物安全柜台面2遍,紫外线消毒30分钟(枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶),复温实验所需试剂细胞培养液(DMEM、1640)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)、胎牛血清(FBS)、双抗,所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态,有无污染。1)倒去培养瓶内的培养液;2)加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次;3)加入胰酶500ul/0.5ml 210min(具体时间因细胞而异,可在显微镜
2、下看是否贴壁,必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落);4)加入含10%FBS的培养液11.5ml培养液:胰酶=(23):1中和胰酶;5)轻轻吹打成单细胞悬液,吹打力度以不起气泡为宜;6)将单细胞悬液吸入1015ml离心管中,低速离心800rpm 3分钟,倒去上清液;7)加入含10%FBS细胞培养液12ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液;8)吸取20ul细胞悬液(10ul细胞悬液+10ul台盼兰液:给坏死细胞染色,判断细胞活力)至细胞计数板,进行细胞计数;CCK-8实验:9)在96孔板中,给每孔加100L(约7000个)的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24-72小时(37,5%CO2),使细胞贴壁;10)
3、向培养板中加入10L不同浓度(5、10、20、40、80、160ug/ml)的待测药物;11)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时(例如:6、12、24或48小时)(药物起作用);注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。12)向每孔加入10L(约10%)CCK-8溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数);13)将培养板在培养箱内孵育14小时(半小时测一次OD值);14)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。15)若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10L0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定,吸光度不会发生变化。测定待测定药物(6个浓度)对肺癌A549细胞增殖的影响,实验加样(最外围的36孔加PBS液,实际上可用60个孔):分组浓度(ug/ml)实验组A加药GO-CHI-HA-SNX-2112细胞+培养基+药物+CCK-8510204080160A0加药细胞+培养基+CCK-8,无药物A空白培养基+CCK-8,无细胞、药物可不做药物+培养基+CCK-8,无细胞
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