PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒

-PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒 文章来源： 2006-7-18 18:54:14  PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒第四军医大学学报2000年第21卷第1期张文清马文煜骆文静姜绍谆胡艳冰侯悦张进于碧云摘要：目的建立一种简便、有效的从细胞培养物中纯化PV1病毒的方法用于水病毒消毒实验.方法PV 1 Henan株在Hep-2细胞中增殖后用聚乙二醇(PEG)6000沉淀结合差速离心的方法纯化病毒. rT-PCR和透射电镜(TEM)鉴定提纯病毒的形态学和分子生物学特性.结果pH值7.5时终浓度70 g·L-1的PEG6000沉淀病毒的感染性回收率(PFU计数)为79.2%，提纯系数(PF)为106，再经差速离心(16000 g 30 min，100 000 g 4.5 h)浓缩病毒的感染性回性率和提纯系数分别为29.0%和168. rT-PCR和TEM最终鉴定提纯物为PV 1 Henan株.结论PEG6000结合差速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离心方法易于操作，且比单独PEG沉淀有更高的纯化系数，是一种简便、有效的方法.关键词：脊髓灰质炎病毒；病毒分离与纯化；聚乙二醇；离心法0引言影响水中病毒消毒效果的因素很多，除了病毒的生物学特性、消毒剂的性质与剂量以及环境温度外,还有水中病毒聚集性、水质酸碱度、离子强度以及病毒周围有机物等1.包绕在病毒周围的有机物，尤其是蛋白类，不仅为病毒提供物理屏障，使消毒剂不易穿透至作用靶点，而且有机物中许多化学基团如巯基还可与氧化性消毒剂产生反应，导致消毒剂有效浓度大为降低. emetson等2报告，臭氧灭活Hep-2. 细胞中的PV和Co*s病毒需要的消毒剂浓时积(CT值)较灭活游离于细胞外的这两种病毒高约150倍,因此在人工制备病毒污染水样时要经过反复冻融感染细胞、超声粉碎、低速离心沉淀细胞碎片以及其它特殊沉淀病毒蛋白、离心提纯病毒的过程.我们采用反复冻融、超声粉碎、低速离心以去除细胞碎片,并进一步用PEG6000沉淀病毒蛋白、差速离心提纯PV1病毒.1材料和方法1.1材料电子显微镜，JEM-2000E*型，日本电子公司；高速冷冻离心机GL-20A型，湘西仪器仪表厂；超速离心机，Centrikont-2080型，瑞士Kontron公司.病毒株与细胞株3，PEG 6000，日本进口，天津天秦公司分装.1.2方法细胞培养与病毒感染按我们先前的方法3.接种病毒35 d出现严重CPE（）后反复冻融细胞56次，再经超声粉碎至细胞完全裂解.病毒原液（S0）在4环境经4000 r·min-1离心30 min后弃沉淀(P1)，留上清(S1)冻存备用. PEG沉淀：在S1中缓慢滴加400 g·L-1 PEG 6000溶液至PEG终浓度为70 g·L-1，并随时搅拌、调整pH至7.5.4过夜后，8000 r·min-1离心30 min后弃上清(S2)，留沉淀(P2).差速离心：用0.01 mol·L-1 pH 7.4的PBS混悬P2后412 000 r·min-1 (16 000 g)离心30 min后弃沉淀(P3)，上清(S3)再经PBS混悬，438 000 r·min-1 (100 000 g)超速离心4.5 h弃上清(S4)，沉淀(P4)混悬后冰浴条件下14 mm振幅超声粉碎2 min，加双抗处理后用灭菌双蒸去离子水稀释，-75冻存.蛋白质浓度测定：按Lowry方法.病毒感染性测定：采用改良的蚀斑试验3. RT-PCR：详见我们先前的实验4.TEM鉴定：30 mL·L-1戊二醛和10 g·L-1饿酸双固定P4中病毒，按常规电镜制作程序用Epon812, dDSA, DMP-30混合液制备包埋块，超薄切片后用醋酸铀和枸橡酸铝染色，透射电镜下观察照相.2结果2.1细胞培养物处理效果细胞冻融、粉碎后低速离心可去除绝大部分细胞碎片(P1)，由Tab1可见，离心降低25%的蛋白，但病毒的感染性仅下降15.8%.表1从细胞培养物中提纯PV1病毒结果tab 1The results of purification of PV 1 from cell culturesSample (No)V/mLProteinVirus infectivityg·L-1%RecoveryPFU/L%RecoveryPFU/gPFaS016006.24100.002.80×108100.00.49×1081.00S115844.7375.002.38×10884.20.50×1081.01P1Discarded-S2Discarded2.80-5.54×106-P240b1.710.698.87×10979.25.19×109106.00S3380.870.335.02×10942.65.77×109118.00P3Discarded-S4Discarded-2.37×107-P424b0.660.165.42×10929.08.21×109168.00a: PF (Purify coefficient)=(S1S4 or P1P4 PFU/mg protein)÷(S0 PFU/mg protein); b: Volume of pellets suspended with PBS buffer.s0: Primary virus solution. S1,S2,S3,S4: supernate,after first,second,third,and fourth centrifugation,respectively. P1,P2,P3,P4: precipitation,after first,second,third,and fourth centrifugation,respectively.2.2PEG 6000沉淀病毒蛋白作用PEG处理后的沉淀物P2能保留79.2%的病毒感染性，同时去除99.1%非病毒蛋白，从而使提纯系数达到106 (Tab 1).2.3差速离心提纯沉淀病毒的作用经一次高速和一次超速离心后可除去P2中约50%的小分子杂蛋白，而感染性回收率分别为42.6%和29.0%，提纯系数分别为116和168(Tab 1).2.4RT-PCR及TEM鉴定结果提取物(P4)电镜检查可见密集分布的直径约30 nm、呈对称颗粒球形的病毒(Fig 1)，与文献一致，而提纯前细胞内质网中见有散在的病毒颗粒(Fig2). RT-PCR扩增后电泳可见一个214 bp特异片断，与阳性对照相同.图1纯化后沉淀物PV1透射电镜鉴定结果fig 1TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain after purification×20000图2纯化前感染细胞透射电镜检查结果fig 2TEM photograph of poliovirus type 1 henan strain in infected Hep-2 cells×120003讨论常用的PV提纯方法是丁醇抽提、酶处理及两次超速离心后，再经速率区带密度梯度离心5，有较高的感染性回收率，但费时费力，不易操作，难以用于经常性提纯使用.而PEG沉淀法适于从含有大量宿主蛋白和磷脂的大体积(通常为数千毫克升)原始材料中选择性沉淀病毒，具有手段温和、非病毒蛋白残留量少等优点，但单独使用则感染性回收率低.本实验通过冻融、粉碎、低速离心等预处理去除细胞碎片而降低沉淀过程中非病毒蛋白的影响，结果显示约25%的细胞蛋白被沉淀去除.在此基础上，用PEG 6000沉淀法结合差速离心，可去除99%以上的非病毒蛋白，感染性回收率为29.0%，提纯系数(PF)168，与单独PEG沉淀(PF为66.4)6相比提高了近一倍；与蔗糖密度梯度离心相比，虽然感染性回收不及前者(47.0%)7，但相对而言，方法简便易行，适合于水中PV消毒实验人工病毒污染水样的经常性制备.作者简介：张文清(1965-)，男(汉族)，安徽省怀宁县人.讲师，博士. 现工作在第一军医大学军队卫生学教研室，广州510525. Tel. (020)7705370-48522Email. 张文清（第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西西安 710033)马文煜（第四军医大学：基础部微生物学教研室， 西安710033)骆文静（第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西西安 710033)姜绍谆（第四军医大学：基础部微生物学教研室， 西安710033)胡艳冰（第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西西安 710033)侯悦（第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西西安 710033)张进（第四军医大学：预防医学系军队卫生学教研室，陕西西安 710033)于碧云（第四军医大学：基础部微生物学教研室， 西安710033）参考文献1友.消毒剂灭活病毒影响因素的研究进展J.中国消毒学杂志，1993；10(3):168-171.2Emerson MA， Sproul OJ, Buck CE. Ozone inactivation of cell-associated virus J. Appl Environ Microbiol， 1982；43(2):603-610.3张文清，姜绍谆，马文煜et al.水中脊髓灰质炎病毒细胞感染模型中病毒株与细胞株的筛选J.第四军医大学学报，1998；19(6):643-645.4张文清，姜绍谆，马文煜et al.水中脊髓灰质炎病毒感染性、抗原性及核酸指标检测方法的评价研究J.第四军医大学学报，1998；19(5):498-500.5戴华生. 新实验病毒学M. :中国学术出版社，1983:595-596.6黄志尚，黄祥瑞，杨佩英et al. Sindbis病毒的浓缩提纯J.中华微生物学和免疫学杂志，1981；1(2):101-103.7马文煜，于碧云，姜绍谆et al.从感染鼠脑浓缩提纯流行性乙型脑炎病毒的研究J.第四军医大学学报，1984；5(4):251-254. z.