细胞免疫染色及畸胎瘤切片的制作流程PPT学习教案

会计学1第1页/共42页第2页/共42页ES细胞或细胞或iPS细胞的密度要求细胞的密度要求无滋养层细胞较好无滋养层细胞较好n传代后至克隆形态良好，密度适中。n通常传至24孔板中。因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。Oct4/DAPI第3页/共42页第4页/共42页材料材料流程流程把细胞固定在4PFA中，室温放置30min 4多聚甲醛（4PFA, Paraformaldehyde）固定细胞之前，将培养基吸弃，用PBS涮2次 n0.1M的PBS配制（PH7.4），100mL PBS加4克多聚甲醛。n由于多聚甲醛难溶于水，需用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60以下。 第5页/共42页第6页/共42页材料材料流程流程n阳性阳性染色对照染色对照：染色呈阴性时，证实染色的有效性n阴性染色对照阴性染色对照：染色呈阳性时，证实染色的特异性n一抗、二抗、一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核n抗体稀释液抗体稀释液：稀释抗体n封闭液封闭液：封闭非特异性反应洗涤细胞洗涤细胞透膜（仅限染核抗体）透膜（仅限染核抗体）一抗孵育一抗孵育二抗孵育二抗孵育染核定位（染核定位（Hochest）第7页/共42页材料材料n阳性阳性染色对照染色对照：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如ES细胞或经过验证的iPS细胞n阴性染色对照阴性染色对照：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。n一抗一抗：要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度n二抗二抗：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。nHoechst：英文名称：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分装后于-20保存；常用的可置于4 ，染色时以1XPBS 1000倍稀释。 n抗体稀释液抗体稀释液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS； 4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。n封闭液封闭液：含1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。第8页/共42页流程流程l所有洗涤，浸泡步骤都在摇床上进行。目的是为了洗涤，浸泡充分均匀。l“洗涤”指将平板置于摇床上摇洗35分钟 把细胞固定在4PFA中，室温放置30min 1X PBS 洗涤2次 抗体稀释液洗涤两次 无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）(此步仅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白) 1X PBS洗涤1次 封闭液封闭细胞，室温，封闭液封闭细胞，室温，1h 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或或4 放置过夜放置过夜(以以24孔板为例，孔板为例，一抗的体积：一抗的体积：200ul/孔孔) 第9页/共42页流程流程吸弃一抗，用PBT（0.1%TritonX100 in PBS）洗涤细胞35次将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置1h; (以24孔板为例，二抗的体积：200ul/孔) 用PBT洗涤3次，约5min/次 用PBS洗涤两次，5min/次 再用4PFA室温固定30min 最后再用PBS洗涤两次，每次5min Hoechst染核, 室温放置5min 第10页/共42页第11页/共42页iPS细胞染色实例细胞染色实例n多能干细胞标记物的常用抗体：n膜抗体：SSEA-1、 SSEA-3、 SSEA-4n胞浆抗体：Tra-1-60、 Tra-1-81n核抗体：Oct4、Nanog、Rex1h阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照Rat-iPSCs第12页/共42页iPS细胞染色实例细胞染色实例阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照hhESCsTra-1-60第13页/共42页iPS细胞染色实例细胞染色实例Pig-iPSCs第14页/共42页iPS细胞染色实例细胞染色实例Human-iPSCs EB 分化染色分化染色Sox17AFPNestin -actinSMATuj1内胚层内胚层中胚层中胚层外胚层外胚层第15页/共42页第16页/共42页第17页/共42页ES细胞或细胞或iPS细胞的收集细胞的收集n细胞数量：一个细胞数量：一个T75长到长到80-90%满时，细胞数大约为满时，细胞数大约为1000万万个，可以打两个点，即每个点约个，可以打两个点，即每个点约300-500万个细胞；万个细胞；n细胞处理：细胞处理： 小鼠及大鼠小鼠及大鼠iPS细胞：将细胞消化成单细胞；细胞：将细胞消化成单细胞；1200rpm离心离心5min后弃上清；以小于后弃上清；以小于400ul的的10%DMEM重悬；重悬； 人人iPS细胞：将消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞细胞：将消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞团块沉底，并弃上清；以小于团块沉底，并弃上清；以小于400ul的的hES培基重悬；培基重悬；n收集细胞到收集细胞到1ml注射器内并注射。注射器内并注射。第18页/共42页ES细胞或细胞或iPS细胞的注射细胞的注射n材料：多重免疫缺陷小鼠（ NODSCID小鼠）n注射部位：后腿内侧肌肉注射第19页/共42页畸胎瘤的生长和摘取畸胎瘤的生长和摘取n通常注射30-40天之后，畸胎瘤就长成直径大概1-2cm左右的球体n当畸胎瘤长到一定体积时，手术摘除畸胎瘤n通常畸胎瘤都是实质性的，也有个别呈空泡状。约约1-2cm第20页/共42页第21页/共42页流程流程固定包埋切片切片材料材料n4%PFA：固定畸胎瘤组织用n石蜡石蜡（熔点约50-60度）：包埋组织n石蜡包埋机石蜡包埋机（非必须）：包埋组织，还需要包埋盒、包埋底n石蜡切片机石蜡切片机（必须）：切半薄“Semi-thick”石蜡切片n染色缸、染色架、载玻片、盖玻片染色缸、染色架、载玻片、盖玻片n溶液溶液：n载玻片：载玻片：防脱片；也可以自制“蛋白胶”涂在切片上晾干乙醇（EtOH）、二甲苯（Xylene）、氯仿（Chloroform）HE染色液（H：Hematoxyline苏木精、E：Eosin 伊红）封片树脂染色架染色缸捞片、展片捞片、展片染色第22页/共42页流程流程固定在4%PFA中固定，4 （浸泡）过夜换成新鲜的 4%PFA ，再次4浸泡过夜（过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性，影响后续的免疫染色）l4固定是为了更好的保持标本的抗原性，室温也可以第23页/共42页流程流程固定包埋之脱水、透明70 EtOH 1h80 EtOH 1h90 EtOH 1h95 EtOH 1h100EtOH 1hFresh 100EtOH 1h Fresh 100EtOH overnight氯仿氯仿 1h新鲜氯仿新鲜氯仿 1h新鲜氯仿新鲜氯仿 overnight 脱水脱水透明透明第24页/共42页流程流程包埋包埋石蜡包埋盒经透明经透明处理的处理的样品样品溶解溶解石蜡石蜡1h2h溶解溶解石蜡石蜡50-60，取决于石蜡的融点，取决于石蜡的融点固定包埋之包埋第25页/共42页流程流程固定包埋 之 包埋n如果没有石蜡包埋机，可以用60 烘箱代替；n利用酒精灯加热镊子可代替高温镊子；n将样品快速放到石蜡包埋底内，盖上包埋盒的底座，直至石蜡全部凝结；n修整蜡块形状、备用。溶解蜡存放槽出蜡口冷冻台高温镊子石蜡包埋盒和包埋底存放槽各种规格的石蜡包埋底第26页/共42页n用单面刀片修整蜡块，并达到以下要求：n（1）蜡块呈正方形或长方形，蜡块各面要平直，样品位于蜡块正中央；n（2）样品边缘与蜡块边缘的距离约3mm。 流程流程固定包埋 之 修整蜡块样品与蜡样品与蜡块边缘有块边缘有一定距离，一定距离，以便切片以便切片能够连成能够连成蜡带蜡带平行平行第27页/共42页流程流程固定包埋切片切片蜡块固定座刀片切片厚度微调旋钮手动切片转轮切片厚度：切片厚度：5微米微米蜡带毛笔第28页/共42页固定包埋切片切片捞片、展片捞片、展片流程流程37蒸馏水蒸馏水载玻片置于37-42 的烘片台（平面）上样品切样品切片片切片借助水的表面张力展开至平整吸除多余水分，37 烤片过夜,备用做好样品ID的标记第29页/共42页流程流程烤片机烤片机37 烤片过夜，防止脱片烤片过夜，防止脱片展片温水槽展片温水槽温度设定：温度设定：37-42左右左右固定包埋切片切片捞片、展片、烤片捞片、展片、烤片第30页/共42页第31页/共42页流程流程 脱蜡亲水脱蜡亲水100% EtOH浸泡2次 10min/次95% EtOH 5min90% EtOH 5min80% EtOH 5min70% EtOH 5min蒸馏水浸洗3次， 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4脱蜡脱蜡亲水亲水（非一次性使用，可反复多次使用）二甲苯浸泡4次 5min/次第32页/共42页流程流程 染色染色在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色，此步骤称为“盐酸分化”(1%盐酸酒精溶液：指染色缸中70酒精中含1%盐酸)将切片 在自来水龙头下流水冲洗15-20分钟，至切片呈理想的紫蓝色，此步骤称“蓝化”（颜色的适宜度取决于染色者的经验）蒸馏水中涮洗一下切片在Eosin溶液中染5min自来水涮洗至水接近无色蒸馏水涮洗一下切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡 10min自来水中涮洗2、3次至水接近无色蒸馏水中涮洗1次第33页/共42页流程流程 脱水封片脱水封片100% EtOH浸泡2次 10min/次脱脱水水二甲苯浸泡4次 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4透透明明（非一次性使用，可反复多次使用）70% EtOH short time80% EtOH short time90% EtOH short time树脂封片，显微镜下观察(以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余的的Eosin颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。70和和80的酒精只要稍稍浸一下即可，的酒精只要稍稍浸一下即可，90的酒精是调的酒精是调整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用)第34页/共42页流程流程在样品中央滴一滴封片树脂固定包埋切片切片捞片、展片捞片、展片封片封片封片树脂避免气泡末端蘸有少量二甲苯的盖玻片第35页/共42页第36页/共42页分化良好的畸胎瘤分化良好的畸胎瘤第37页/共42页外胚层外胚层神经上皮神经上皮色素上皮色素上皮角质上皮角质上皮第38页/共42页中胚层中胚层脂肪组织脂肪组织肌肉组织肌肉组织软骨组织软骨组织骨组织骨组织第39页/共42页内胚层内胚层呼吸上皮呼吸上皮腺体组织腺体组织原始肾脏组织原始肾脏组织第40页/共42页第41页/共42页