生物化学实验十 动物基因组DNA提取最终稿

一、实验目的二、实验原理及方法三、实验器材四、实验步骤学习和掌握从动物组织中提取基因组DNA的原理和操作技术1 核酸的理化性质2 核酸制备的步骤3 核酸制备中常见问题及注意事项（1 1）在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在）在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在（2 2）微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂）微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂（3 3）在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较）在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较 稳定。稳定。（4 4） DNA DNA溶液粘度很大溶液粘度很大（5 5）在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来）在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来 I. I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中 破裂细胞破裂细胞 释放核酸释放核酸 机械法与非机械法机械法与非机械法（非机械法中（非机械法中溶胞法溶胞法是应最广泛的方法）是应最广泛的方法）破裂细胞破裂细胞 、释放核酸、释放核酸以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂lDNase抑制抑制 加入少量金属离子螯合剂，如加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA0.01 mol/L EDTA或或柠檬酸钠，柠檬酸钠，DNaseDNase基本可以全部失活。基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及去垢剂、蛋白变性剂及DNaseDNase抑制剂也可使抑制剂也可使DNaseDNase失活。失活。 l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用：去垢剂的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；来； 3 3对对RNase、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1.5-1.5-二磺酸二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠钠、三异丙基萘磺酸钠 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离： 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）类分子）非需要的核酸分子、试剂和溶液非需要的核酸分子、试剂和溶液核酸制备中常用的蛋白质变性剂作用：作用： 1. 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。造成蛋白污染。 2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作活性和破裂细胞的作用。用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC沉淀可去除部分杂质与某些盐离子沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用少数盐类可使用70-75%70-75%的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸保存的主要条件是温度和介质 温度温度： 4 4 样品经常使用样品经常使用 -70-70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存在在DNADNA溶液溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。 -20-20保存保存, ,避免反复冻融避免反复冻融 保存介质保存介质： 灭菌水灭菌水 TETE缓冲溶液缓冲溶液( (最常用最常用) )：TETE缓冲液的缓冲液的PHPH与与DNA DNA 贮存有关，贮存有关，PHPH为为8 8时，可减少时，可减少DNADNA脱氨反应，脱氨反应，PHPH低于低于7.07.0时时DNADNA容容易变性。易变性。 10mmol/L 10mmol/L Tris-ClTris-Cl pH8.0 pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 基因组DNA收率较低或无基因组DNA 样本材料太少 细胞破裂不够充分，DNA释放不完全 离心力偏小 两相分离不完全 DNADNA降解的原因降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？ 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除净 基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组提取基因组DNADNA，有时加入蔗糖的原因有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护加入多糖，保护DNADNA长度长度核酸制备时应注意的事项: 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解：排除防止核酸的生物降解：排除核酸酶核酸酶实验材料：鱼实验试剂：上海生工动物基因组DNA快速抽提 试剂盒实验器材： 仪器：高速离心机、水浴锅 试剂：75%乙醇、异丙醇、Rnase A 溶液等 耗材：1.5ml离心管、研钵 2.加入200l Buffer PA，充分颠倒均匀，置-20于冰箱放置5min。1.取25-50mg（半个绿豆大小）动物组织加到冰浴的1.5ml离心管中，用剪刀剪碎，加入400l Buffer Digestion，振荡混匀。65水浴1.5h至细胞完全裂解。通常动物组织完全裂解需要1-3h，取样过多会影响提取DNA的质量（动物脾脏取样量应=10mg）。水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，可促进细胞裂解。水浴后加入20l RNase A (20 mg/ml)6.重复步骤5一次。5.加入1ml 75%乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rpm离心2min，弃上清。漂洗时一定要是沉淀悬浮起来。4.加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min。室温10000rpm离心5min，弃上清。3.室温10000rpm离心5min，将上清液（500-550l）转移到新的1.5ml离心管。若上清液浑浊，可在加入等体积氯仿混匀，12000rpm离心取上清。8.得到的DNA用100-200l TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20保存。TE Buffer为10mM Tris-HCl,1nM EDTA,pH8.0,可以用Elution Buffer或水代替。7.开盖室温倒置5-10min至残留的乙醇完全挥发。此步决不可省略，否则残留的乙醇会严重影响后续实验如果残留的乙醇有挂壁现象，倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。然后开盖室温放置5-10min至残留的乙醇完全挥发。过度干燥将导致DNA重新溶解困难，肉眼可见DNA沉淀变成半透明状，离心管无明显乙醇味道即可，避免使用真空干燥器进行干燥。Buffer digestion：主要成分是Tris-EDTA,SDS。 SDS是表面活性剂有助于DNA的释放， Tris的作用是调节PH， EDTA是螯合剂，是结合核酸酶放置DNA的降解。Buffer PA：主要成分是醋酸盐溶液， 主要作用是沉淀蛋白质，纯化DNA。 浓度浓度鉴定鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 完整性鉴定完整性鉴定