运动生物化学实验指导及报告(6h).doc

运动生化实验指导 学院 年级 班级 学号 姓名宁夏师范学院体育学院目 录实 验 须 知 2实验一 基本操作 3-7实验二 血糖测定 8-9实验三 血红蛋白测定 10-11实验四 运动对血乳酸含量的测定 12-14实 验 须 知1实验室规则(1) 实验课必须提前5分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。(2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给教师。(6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。(7)每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。2实验记录 实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。 实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。3实验报告的书写实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。按照实验内容可分为定性和定量两大类，实验报告的格式：实验序号，实验名称；目的和要求、内容与原理、主要仪器及试剂配制、操作方法与实验步骤、结果与讨论。定性实验报告中的实验名称和目的要求是针对该次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在完成实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以流程简图的方式或自行设计的表格来表示。结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题和思考题进行探讨以及对实验的改进意见等。定量实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。实验一 基本操作一、目的及要求 1.熟悉实验室规则及常用生化仪器名称。 2.学会清洗玻璃仪器的正确方法。 3.学习并掌握各种常用仪器的正规操作及维护。4.了解分光光度计、离心机等仪器设备的工作原理。二、常用生物化学仪器 烧杯、容量瓶、量筒、试管、离心管、刻度吸管、滴管、搅棒、漏斗、混匀器、恒温水浴箱、煮沸消毒箱、冰箱、离心机、分光光度计、可调式移液器等三、操作步骤（一）清点仪器 按照仪器清单，逐项查点各个仪器是否完好（如有缺损或吸量管堵塞等应及时补充更换）。本套仪器由清点人使用保管至实验课程全部结束。（二）玻璃仪器的洗涤 1. 洗涤：各种玻璃仪器的清洁程度直接影响实验结果的准确性。应根据实验要求、污物性质和玷污程度选用合适的清洁方法。 A.非定量敞口玻璃仪器，如试管、离心管、烧杯等，均可直接用毛刷蘸洗涤灵或洗衣粉刷洗，然后用自来水反复冲洗干净，最后用少量蒸馏水洗三遍。 注意：洗前检查毛刷顶端铁丝是否裸露，洗刷时不可用力过猛，以免损坏仪器。 B.定量玻璃仪器，如滴管、吸量管等。先用自来水冲洗凉干，然后于洗液中浸泡数小时，取出待沥净洗液后，用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗23遍。 C.比色杯用毕立即用蒸馏水反复冲洗，避免用碱液或强氧化剂清洗，切不可用试管刷或粗布（纸）擦拭。 2.清洁的标准：玻璃仪器洗净后，以倒置后内壁不挂水珠为清洁标准。 3.铬酸洗液的配置 A.称取K2Cr2O7 5g 置于500ml烧杯中 加蒸馏水 5ml使其尽量溶解 缓慢加入浓硫酸 100ml边加边搅拌，待冷却后使用。B.使用注意事项：洗液是强氧化剂，有很强的腐蚀性，使用时注意不要滴溅到衣物及实验台等处，拿取洗液中的玻璃仪器时，需戴耐酸手套，切忌用手直接拿，如不小心溅到皮肤上，立即用大量清水冲洗。（三）移液器的使用1.基本原理移液器（有的称“移液枪”、“取液器”）是一种取样量连续可调的精密取液仪器，基本原理是依靠活塞的上下移动。其活塞移动的距离是由调节轮控制螺杆机构来实现的，推动按钮带动推杆使活塞向下移动、排除了活塞腔内的气体。松手后，活塞在复位弹簧的作用下恢复其复位，从而完成一次吸液过程。2.操作方法（参见图1）（1）将一个吸液尖装在吸液杆上，推到套紧位置以保证气密性。（2）转动调节轮，使读数显示为所要取液体的体积。 图1 移液器的使用（3）轻轻按下推动按钮，将推动按钮由位置“0”推到位置“l”。（4）手握移液器，将吸液尖垂直浸入待取液体中，浸入深度为24mm。（5）经23s后缓慢松开推动按钮，即从推动按钮位置“1”复位到“0”位，完成吸液过程，停留12s后将移液器移出液面。（6）用纱布或滤纸将粘在尖头外表面的液体擦掉。注意不要接触到吸液尖头部的孔表面。（7）将吸液尖头部放入被分配的容器中，使尖贴着容器的内壁，然后慢慢按下推动按钮至位置“1”，继续按至位置“2”，此时液体应全部排净。（8）将吸液尖口部沿着容器内壁滑动几次，然后移走移液器，松开推动按钮，按卸尖按钮推掉吸液尖，即完成一个完全的操作过程(5000ul移液器不带卸尖器)。 3.使用注意事项（）移液器属于精密仪器，取液前应先调好调节轮。（）排液时要按动二档至图示位置“2”，以便排净液体。（）为获得较好的精度，在取液时应先用吸液的方法浸渍吸液尖，以消除误差。因为当所吸液体是血浆类、石油类和有机类液体时，吸液尖的内表面会留下一层薄膜。因为这个值对同一个吸液尖是一个常数。如果将这个吸液尖再浸一次，则精度是可以保证的。（）浓度大的液体消除误差的补偿量由试验确定，其取液量可通过增加或减少数轮的读数加以补偿。（）当移液器中有溶剂时，移液器不准放倒防止残留液体倒流。（）吸取少量液体时最好不要用大体积的移液器。（）使用移液器之前应看清其刻度，不要调节的超过其最大刻度。（四）吸管的使用 吸管是生物化学实验中最常用的取量容器。用吸管移取溶液时，一般用右手的中指和拇指拿住管颈刻度线上方，把管尖插入溶液内大约1cm处，不得过深与过浅。用洗耳球吸液体至所需刻度上，立即用右手食指按住管口，提升吸管离开液面，使吸管末端靠在盛溶液器皿的内壁上，略微放松食指，使液面平稳下降，直至溶液的弯月面与刻度标线相切(注意，此对溶液凹面，刻度和视线应在一个水平面上)，立即用右手食指压紧管，取出吸管，插入接受容器中，吸管垂直，管尖靠在接受器内壁，接受器约15夹角，松开食指，使液体自然流出。标有 “吹”字的刻度吸管以及奥氏吸管应吹出尖端残留液体，其他吸管则不必吸出尖端残留液体。量取液体时，应选用取液量最接近的吸管。如欲取1.5ml液体，应选用2.0ml的刻度吸管，另外，在加同种试剂于不同试管中、且所取量不同时，应选择一支与最大取液量最接近的刻度吸管。例如，各试管中应加试剂量为0.3，0.5，0.7，0.9ml，则应选用一支量程为1.0ml的吸管。（五）离心机的使用1.原理 利用物质的质量、密度、形状等物理性状的差异，在一定介质中通过离心力（场）作用，使物质沉降的过程称为离心。产生离心力的机械是各种类型的离心机。待分离的物质一般被悬浮在一种特殊的液体介质中，盛有这种介质的离子被放置在离心机转头内。转头的中央位于离心机的驱动轴上。离心介质的浮力密度、粘度、阻力影响物体的沉降速度。通过对离心力以及离心介质的选择，可以分离纯化出不同质量大小和物理形状的物质。2.操作（）离心前应检查： 取出所有套管，起动空载的离心机，以检查离心机是否转动平衡。检查套管内软垫是否完好，有无其它异物。离心管与套管是否匹配。（2）平衡： 将一对离心管放入套管内，离心管内装等量的待离心溶液，置于天平两侧，如不平衡，用滴管向较轻一侧的离心管与套管之间加水直至平衡。（3）离心： 将等重的两管置于离心机中的对称位置，调节转速钮，逐渐增加转速至所需速度，计时。（4）离心结束：将套管的水倒净，所有套管放回离心机中。3.使用注意事项： A.离心的起动、停止都要慢，否则离心管易碎或液体从离心管中贱出。 B.离心过程中，若听到特殊响声，应立即停止离心，检查离心管。若离心管已碎，应清除并更换新管；若管未碎，应重新平衡。（六）722型分光光度计的使用1.原理分光光度计是应用分光光度法（即比色法）测定物质含量（即浓度）的仪器。具有操作简便，灵敏度高等优点。当利用比色法测定溶液中某种化学成分时，通常需加入某种显色剂，使其产生有色化合物，而且其颜色的深浅与待测化学成分的含量成正比，据此测定待测物的浓度。分光光度法的原理及计算公式均是依据Lambert-Beer定律，即一束单色光通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度（或厚度）不变，则溶液的厚度（或浓度）愈大，光线强度的减弱也愈显著。分光光度计通常是把溶液的厚度固定不变，通过光密度值表现溶质的浓度。若用待测物的纯品配制不同的浓度，测出其光密度，绘出浓度对光密度的工作曲线，便可以此查得未知样品的浓度，还可依据下列公式对未知样品的浓度通过计算得出。测定管的浓度标准管的浓度测定管的光密度值 标准管的光密度值=测定管的光密度值标准管的光密度值测定管的浓度= 标准管的浓度 2.仪器的使用方法（）使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操作旋钮之功能。在末接通电源前，应该对仪器进行检查，电源线接线应牢固，通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应正确，然后再接通电源开关。（）将灵敏度旋钮调置“1”档(放大倍率最小)。（）开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置测试用波长。仪器预热20min。（）打开试样室盖(光门自动关闭)，调节“0”旋钮，使数字显示为 “00.0”，盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100”旋钮，使数字显示为“100.0”。（）如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能倍率置低档使用，这样仪器将有更高的稳定性。但改变倍率后必须按(4)重新校正“0”和“100”。（）预热后，按(4)连续几次调整“0”和“100”，仪器即可进行测定工作。（）吸光度A的测量：按(4)调正仪器的“00.0”和“100”后，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。（）浓度C的测量：选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。（）如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100”后稍等片刻，(因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和“100”即可工作。（）每台仪器所配套的比色皿，不能与其他仪器上的比色皿单个调换。（）仪器数字后盖，有信号输出01000mV，插座1脚为正，2脚为负接地线。3.注意事项（1）分光光度计属精密仪器，应精心维护，防震、防潮、防腐蚀。（2）比色杯要保持清洁，其透光面忌用手触摸或接触粗糙物体，比色杯中的液体应适量，外壁应用擦净纸擦干，如杯中溶液为强酸或强碱，应尽快比色，经防腐蚀比色杯。（3）比色时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳。（4）用后应将所有开关、旋钮移至原位，关闭电源，清洗比色杯，倒置于比色杯架上（5）比色杯必须成套使用，注意保护。清洗时用0.1mol/LHCl和乙醇溶液或稍加稀释的洗涤液浸泡去污，用蒸馏水充分清洗干净，晾干备用。思考题 1.离心操作的关键是什么？如何才能做到？ 2.若量取0.4ml液体，应选取哪种规格的刻度吸量管实验二 血糖的测定一、目 的了解分光光度法的基本原理,熟悉分光光度计的操作方法,为今后应用该仪器奠定基础。二、原 理葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺，后者脱水成雪夫氏碱，再经结构重排，生成有色化合物。颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。三、试 剂1.邻甲苯胺试剂 于940ml 冰醋酸中加入硫脲1.5g，邻甲苯胺60ml，混合，直至硫脲完全溶解，置棕色试剂瓶，室温保存。新配试剂应放置24小时后（待老化）使用。此试剂腐蚀性强，避免接触皮肤，应用自动吸管加液。2.12mmol/L苯甲酸溶液，于900ml蒸馏水中加入苯甲酸1.4g，加热助溶，冷却后置于1L容量瓶中，加蒸馏水至刻度。3.葡糖糖标准储存液（100mmol/L） 称取无水葡糖糖（预先置80C烤箱干燥至恒温重，移置干燥器内保存）1.802g，溶解于80ml苯甲酸溶液中，移置100ml容量瓶中，再加苯甲酸溶液至刻度。4. 葡糖糖标准应用液（5mmol/L） 取葡糖糖标准储存液5ml，置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。四、器材 16150mm试管、吸管、煮沸消毒箱、722分光光度计、血清。五、操作 1.取16150mm试管3支按下表进行操作：试剂（ml） 测定管 标准管 空白管 沸水浴（分钟） 自来水冷却（分钟） 血清或血浆 0.1 12 5葡萄糖标准应用液 0.1 12 5蒸馏水 0.1 12 5邻甲苯胺试剂 3.0 3.0 3.0 12 52.用波长630nm分光光度计进行比色，空白管调节零点，读取测定管与标准管吸光度。3.计算： 血糖（mmol/L）=测定管吸光度标准管吸光度54.本测定法空腹血糖正常值为3.896.11 mmol/L(70-110mg/dl)。【思考题】1.722分光光度计的原理及技术。2.联系实际讨论血糖升高和降低的意义及其维持血糖恒定的因素。 运 动 生 物 化 学 实 验 报 告班级： 专业： 姓名： 性别： 身高（cm）： 体重(Kg)：实验名称：实验原理：主要操作（表格式或条文式）结果：结论：分析讨论：实验三 血红蛋白测定（沙利氏比色法）一、目 的掌握皮肤采血技术、仪器使用、操作方法及正常参考值二、原理 红细胞经盐酸破坏放出血红蛋白，并将其转变成褐色酸化血红素，其色泽深浅与血红蛋白含量成正比。经与标准比色版比色，得出100毫升血液之血红蛋白克数。三、仪器与试剂1.沙利氏比色计2. 1盐酸溶液四、方法1.先于血红蛋白比色管中加入1盐酸到“10”刻度处。2.消毒、穿刺耳垂或指腹，用血红蛋白吸管采血20立方毫米，轻轻吹入比色管中，混合。3.将比色管插入比色座内，放室温中10分钟后，向比色管中徐徐滴加蒸馏水，对着光线边加边用细玻棒搅拌，至色泽与两侧标准比色板相同为止。读取比色管凹面与刻度平行处的克数。五、正常值参考值 男性成人 1216克/100毫升女性成人 1115克/100毫升新生儿 1720克/100毫升运 动 生 物 化 学 实 验 报 告班级： 专业： 姓名： 性别： 身高（cm）： 体重(Kg)：实验名称：实验原理：主要操作（表格式或条文式）结果：结论：分析讨论：实验四 运动对血乳酸含量的影响（杨氏改良法）有氧的情况下，机体主要依靠糖的有氧氧化供能，但在氧气供应不足的条件下，储存在肌肉中的糖原或葡萄糖，主要依靠糖酵解，终产物是乳酸，乳酸经扩散进入血液，称血乳酸。然而在剧烈活动时，由于心肺功能的限制，在短时间内无法提供体内糖完全氧化时所需的氧气量，肌肉处于相对缺氧的状态，这时能量的供应主要依靠加强糖酵解作用来获得。因此，糖酵解是剧烈运动时能量的主要来源。据研究证明，血乳酸的含量与运动强度关系密切，血乳酸可作为评定运动强度的生化指标，而且高乳酸的训练有利于提高运动员的速度耐力素质。增强运动员的耐酸能力。因此，血乳酸含量的测定，对于从事体育工作的人来说是很重要的。安静时血乳酸的正常值为918mg/100ml溶液（2mmol/L）。一、实验目的 1.学会测定血乳酸的操作方法及理解其作用原理 2.进一步巩固移液管和试管实验的操作技术二、实验原理 将血液中的蛋白质除去后，加浓硫酸共热使乳酸变成乙醛，当铜离子存在时，乙醛与显色剂对羟基联苯反应，生成紫红色复合物，其颜色的深浅程度与乙醛的含量成正比，再用同样方法处理标准液，以空白管调零比色，即可求出血乳酸的含量。三、实验试剂与仪器（一）实验试剂1、1氟化钠（NaF）溶液2、10三氯醋酸溶液3、4硫酸铜（CuSO4.5H2O）溶液:取硫酸铜4g,加蒸馏水50ml，可加热助溶后冷却，加蒸馏水稀释至100ml。4、浓硫酸（比重1.838，GR）5、1.5对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯1.5g，用10ml 5NaOH溶液中，加热约80助溶后冷却，加蒸馏水稀释至100ml，贮存于棕色瓶中。6、乳酸贮存标准液（0.05mg/ml）：称取无水乳酸锂106.5mg溶于20ml蒸馏水中，加浓硫酸2滴，加水至100ml。（此液含乳酸1mg /ml），置于冰箱中可长期保存。7、乳酸应用标准液（0.05mg /ml）：取贮存液5ml，以蒸馏水稀释至100ml，当天配用。（二）仪 器恒温水箱、沸水箱、离心机、721分光光度计采血针、吸管、离心管、刻度试管及试管架、不同大小的移液管和洗耳球消毒棉球及干棉球四、操作步骤 1、取运动前和运动后的末梢血。2、取8支试管，编号，按下表加试剂试 剂 测 定 管 标 准 管 空 白 管 运动前 运动后1氟化钠（ml） 0.48 0.48 0.4 0.25末梢新鲜血（ml） 0.02 0.02 乳酸标准应用液（ml） 0.1 10三氯醋酸液（ml） 1.50 1.50 0.75 0.75将上述各管充分混匀。3、将测定管离心，3000rpm10分钟。然后取上清液分别置于另一洁净试管中备用，弃去沉淀物。4、在两测定管中各取1ml分别置于另一洁净试管中。5、在标准管、空白管和上述操作4的各管加入4硫酸铜4滴，混匀。然后逐滴加浓硫酸6ml，边加边摇匀，再继续下述操作。6、在沸水浴中加热4分钟，立即放在冷水中使冷至15以下。7、每管加对羟基联苯6第，立即摇匀，使白色絮状物散失。8、把各管置30水浴中保温30分钟，每10分钟摇动试管一次。9、将各管置沸水浴中加热90秒钟，时间必须控制准确。然后置冷水浴中冷至室温。10、用650nm波长比色（比色杯光径1cm），记录各管的光密度值。五、计算测定管光密度标准管浓度=血乳酸mgX 标准管光密度 注意事项1、采血时避免挤压，采好后立即吹入1氟化钠溶液，并立即加入10三氯醋酸液摇匀。2、浓硫酸最好是保证试剂，如有可能，滴加浓硫酸时最好在漩涡混匀器上进行。3、对羟基联苯加入后立即混匀，使沉淀物变成小颗粒。4、沸水浴90秒要准确。5、安静为运动前。剧烈下蹲运动直至下肢发酸为止为运动后。 运 动 生 物 化 学 实 验 报 告班级： 专业： 姓名： 性别： 身高（cm）： 体重(Kg)：实验名称：实验原理：主要操作（表格式或条文式）结果：结论：分析讨论：