大实验—土壤酶活性的测定解析

4.2.5 土壤前活性的测定月尿能活性的测定采用奈氏比色法,以 1 g干土 24 h生成的NH3-N量为版幅的1 个活性单位41.过氧化氢能活性的测定采用高镒酸钾滴定法.能活性以1 g干士1 h内消耗的0.1 mol L-1KMn04体积数（以ml计）表示42多酚氧化前活性的测 定采用邻苯三酚比色法，以1 g干土 3h内生成的没食子素的量为多酚氧化前的 1个 活性单位43,脱氢能活性的测定采用三苯基四氮口坐氯化物作为氢受体。被还原后生成红色的甲月赞，用比色法测定，以 1 g干土 6h生成的甲1赞质量为脱氢酶的1个活性单位44。1 .版幅活性的测定 苯酚钠比色法1标准曲线的绘制吸取稀释的氮的标准溶液1, 4, 7, 10, 13, 16, 19mL,移入50mL容量瓶中，然 后加蒸储水至20mL o再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据光密度值 与溶液浓度绘制标准曲线。绘制的标准曲线如图4-1所示：1 政部10 061 ；图4-1月尿酶标准曲线2操作步骤取5g风干土，置于50mL三角瓶中，力口 1mL甲苯。15min后加10mL10%尿素液和20mL PH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在 37 c恒温箱中培养24h。过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测月尿前活性以24h后1g 土壤中NH3-N的毫克数表示。2 .过氧化氢能活性的测定一一高镒酸钾滴定法1操作步骤取5g 土壤样品于100mL三角瓶中用不参加土样的作空白对照，力口 0.5mL甲 苯，摇匀，于4c冰箱中放置30min。取出，立刻参加 25mL冰箱储存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于 4c冰箱中放置1h。取出，迅速参加冰箱储 存的2mol/L H2SO425mL ,摇匀，过滤。取1mL滤液，用的KMnO4滴定。2计算根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的 H2O2的量所消耗的KMnO4。幅活 性以每g干土 1h内消耗的体积数以mL计表示。3 .脱氢能活性的测定 一一三苯基四氮口坐氯化物TTC复原法1方法原理脱氢酶能酶促脱氢反响，它起着氢的中间传递体的作用。在土壤中，碳水化合物 和有机酸的脱氢能作用比较活泼，它们可以作为氢的供体。脱氢能能自基质中析 出氢而进行氧化作用。用三苯基四氮口坐氯化物作为氢的受体，进行比色测定，以 溶液的光密度值表示幅活性。2TPF标准曲线的绘制于干净20mL具塞试管中，依次参加缓冲液、2mL蒸储水和2mL不同浓度的TTC标准溶液，然后参加0.1g低亚硫酸钠保险 粉，振荡摇匀。待充分显色后，参加 5mL甲苯，振荡萃取TPF,上清液于485nm处测定吸光度值。以TPF的浓度为横坐标，以OD485值为纵坐标绘制标 准曲线。绘制的标准曲线如图 4-2所示：I U Ji取111 母图4-2TPF标准曲线3操作步骤称取5g 土壤样品，置于干净具塞试管中，每支试管参加 2mL1%的TTC溶液，2mL蒸储水，充分混匀。置于37 c条件下避光培养6h。培养结束后，参加5mL甲 醇，剧烈振荡1min,然后静置5min ,再振荡20s,然后静置5min。将具塞试管中的物质全部过滤到比色管中，并用少量甲醇洗涤具塞试管 23次，洗涤液也全部 过滤到比色管中，定容到 25mL,于485nm下测定吸光度值 OD485 ,以每g干土 6h 生成的TPF为脱氢酶的一个活性单位。4.多酚氧化能活性的测定一一邻苯三酚比色法1标准曲线的绘制取重铭酸钾标准溶液，用稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于 430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 绘制的标准曲线如图4-3所示：图4-3重铭酸钾标准曲线2操作步骤称取1g风干土壤样品过 0.25mm筛，置于50mL三角瓶中，然后注入10mL1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在 30 c恒温箱培养2h。取出后加4mLPH4.5柠檬酸一磷酸缓冲液，再加35mL乙醛，用力摇荡数次，萃取 30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醛相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片，为防止因乙醛引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的酸溶性有机物质而引起的误差及校正没食子素的纯度，需 设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤的对照中，用水代替基 质进行培养。3活性表示紫色没食子素的量，根据用重铭酸钾绘制的标准曲线查知。多酚氧化酶活性，以每 g干土 2h内生成的紫色没食子素的毫克数表示。