线粒体DNA提取方法的比较

#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期?论著？#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期线粒体DNA提取方法的比较国家"九七三”项目资金资助(G1999054202 )李伟文陆松敏刘建仓武凡李萍柏干荣第三军医大学野战外科研究所（重庆，400042 ）摘要 目的 将提取线粒体DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较，以得到最方便快速提取线 粒体DNA的方法。方法 分离W istar大鼠小肠上皮细胞，用3种方法提取线粒体DNA ,紫外分光光度法定量。用 琼脂糖凝胶电泳和线粒体 ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果 改进高盐沉淀法线粒体DNA 量最多，T riton法最少。0D 260 OD 280均在1. 78- 1. 85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于PCR扩增,测定出了线粒体DNA ATPase 8亚基基因序列。结论改进高盐沉淀法提取线粒体 DNA具有操作简单， 产量多的优点，该法所提取m tDNA可用于m tDNA测序。关键词 线粒体；DNA ;分子遗传学192?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期193?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得 到线粒体DNA (m tDNA ),进行了全序列分析。此 后,m tDNA的研究日益得到重视。本实验将T riton 法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较，发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1材料和方法111试剂和溶液琼脂糖系Promega产品，其它生化试剂系国产 分析纯。 溶液 ：含 Tris2HCI 10 mmol L , N aCl 10 mmol L ,M gCI2 5mm o l L pH 7 5; 溶液 ：Tris2HC l 10 mmol L , N aCl 400 mm o l L , EDTA 2 mm o l L pH 8 0; 溶液A :含50 mmol L葡萄糖，25 mm o I L T ris2HC l 30 mmol L EDTA Na2,pH 8 0; 溶液 B: 0. 2mol L N aOH 含 1%SDS(临用 前用5mol L N aOH和10% SDS贮存液配制); 溶液C: 3mol L醋酸钾溶液,pH 5 4,含5 mol L醋酸根离子； Trit on 溶解液：含 10 mmol L KC l, 15mm ol L T ris2HC I, pH 8 3,2 5mm ol L M gCl2,1%V V Triton X2100; KDNA BamH M arker 16841、7233、6770 6527、5256 5505 bp; BD 2000 M arker 3000, 2000, 1000, 750, 500, 200 bp。112细胞分离大鼠颈椎脱臼处死，剖腹取远端回肠约 30 cm。 先用37 C生理盐水冲洗肠腔后，注入0. 25%枸盐酸 钠生理盐水溶液，直至近充盈为止。结扎两端，置于 盛有37C生理盐水的三角烧杯中，恒温摇床50 r m in, 20 m in。弃内容液，分为8段，每段加含0. 02 % EDTA生理盐水2m I. 37C恒温摇床100 r m in, 35m in,轻轻挤压一遍,100 r m in, 5m in。收集肠内 容液，加入约12ml生理盐水,2500 r m i n, 10m i n, 弃上清，沉淀再加入生理盐水 ，2500 r m in, 5 m in 重复洗涤一次.计数后进行mtDNA提取。113 mtDNA提取及纯化1 3 1 T riton法 取10细胞沉淀，悬浮于5 m I 的T riton溶解液中。温和振荡片刻后，室温下放置 10m in。反应完毕的溶液以 8000 r m in离心1 m in, 上清即为m tDNA。1 3 2碱变性法2取107细胞沉淀，依次加入溶 液A （4 C ） 150 Al,冰浴中将沉淀吹打分散后加入 300 AI溶液B （常温），将Eppendrof管缓慢颠倒10 次,冰浴裂解变性 4 8min,再加入225 A溶液C（0 4 C）,轻柔混匀，冰浴复性20- 25 m in。反应完毕 的溶液以10000 r min离心6min,4C ,取上清。1 3 3改进高盐沉淀法3取107细胞沉淀，加入溶 液 5500 A,混匀,2000 r m in, 10min,弃上清。沉 淀加溶液 5500 Al,混匀，3500 r min, 10min,弃 上清。沉淀加溶液 950 A,混匀后加入20mg m I 蛋白酶K 50 A和10% SDS 120 A,快速混匀。40C 过夜或50 C 4 h。加入300 A饱和醋酸钠，混匀，轻 摇 15S。15000 r m in, 4 C , 15 m in ,取上清于Eppendrof管中。取上清后步骤相同。上清中加入等 体积酚：氯仿：异醇 （25 : 24 : 1）,温和振荡 8 m in, 10000 r min, 10m in 4C ,取上层水相重复该 过程抽提一次，轻取上层水相。加入2倍体积冰乙醇 或等体积异丙醇,冰浴30 min,15000 r m in, 10m in,弃上清。用70%冰乙醇漂洗沉淀 ，15000 r m in, 2m in,彻底去上清。沉淀于空气中自然部分干 燥25 mi n,加入适量RTE液溶解。贮于4C。114 mtDNA样品鉴定1. 4 1紫外分光光度法测定样品经适当稀释 ，用 BECKMAN DU 7500紫外分光光度计定量。1. 4 2琼脂糖凝胶电泳 电泳用 DYY 2 2型电泳 仪,0. 7%琼脂糖凝胶,取6 N溶解液与2內上样液 混 匀后点样，与 KDNA BamH M arker比较， 100V 4m i n,50V 60 m i n,紫外灯下观察并拍照 。1.4 3聚合酶链反应（PCR）检测 以改进高盐沉淀 法所提取m tDNA样品作为模板，测定线粒体DNA A T Pase 8亚基基因序列。2个引物由上海博亚生物 工 程 公 司 设 计，1A :5 '2A CAA T GACA T GCCA CAA C231B:5 '2GGGAA CA TAA T AA T GGTCA C23;扩增长度 248bp。扩增PCR标准反应体系在0 5 m lEppendrof管中进行，反应总体积为 50 Al。加入10x buffer 5 Al, M gCI2 （25 mmol L ） 3 6 Al, 4 x dNTP 3 6 A,引物 1A 1B （0. 5 A Ag）各 1. 4 A, 模板（0. 03 A A） 10 Al, PCR用水27 A,石蜡油 23 A, 95C预变性 220 s,加入TaqDNA 聚合酶0. 9A。循环条件，95C变性40S, 55C退火30S,72C延 伸36S,反应30个循环，最后72 C延伸10 min.用DYY2 2型电泳仪，2%琼脂糖凝胶，取4 Al溶液与1 A上样液混和后点样，与BD 2000 M arker比较， 100V 4mi n,55V 35 m in后紫外灯下观察、拍照，并 进行DNA序列测定。2结果211 mtDNA的紫外吸收光谱分析mtDNA样品浓度在0. 313 Ag A之间。OD 260 OD280在1. 78- 1. 85之间，改进高盐沉淀 法所提取m tDNA量最多，碱变性法次之，T riton法 最少（表1）。#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期表1几种方法提取m tDNA量的比较（x0± s, n= 8）1 T riton 法碱变性法高盐沉淀法m tDNA 量（Ag A）0.21 ± 0.020 30 ± 0 02313 29 ± 0. 883 3 ?注 :3 P < Q 05 （碱变性法与T riton法比较）,33P< Q 01（高盐沉淀法与Triton法比较）；?P< 0 01（高盐沉淀法与碱变性法比较）#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期212 mtDNA琼脂糖凝胶电泳分析3种方法所提取mtDNA样品电泳后，均可见16 3 kb的单一 mtDNA条带（图1）。改进高盐沉淀 法提取mtDNA电泳条带最亮，Triton法的最弱。#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期图13种方法提取mtDNA琼脂糖凝胶电泳图A、E 泳道为 KDNA BamH IM arkers ,B、C、D泳道分别为高盐沉淀法、碱变性法、T riton 法提取 ntDNA。SDObp Ikb图2 A TPase 8基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳A、B 泳道分别为 BD 2000 M arker , 248 bp产物#?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期194?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期1994-201U Cfiinzi Aw血J心mrilal E143ClfiMiic Publishi.ing 巴 Allr皿已dil.213 PCR产物分析扩增产物图谱为248 bp左右片段（图2）。送上 海博亚生物工程公司测序，将测序结果经计算机GenBank查询，发现与 W istar大鼠 mtDNA A T Pase 8亚基基因同源性在99% ,确定为线粒体基因，位置为773才7983。3讨论自A nderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA后，有人参考T amura和Palva提取动物组 织mtDNA的方法，结合碱变性法提 20 kb以下质 粒DNA原理，提取了人肝组织中 mtDNA。胡义德国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期195?对该方法进行了改进。戴纪刚建立通过核质分离，即 利用非离子型去污剂T riton 2100能溶解核被 膜以外的所有细胞膜的特点 ，分离细胞核 细胞质，来 获取m tDNA。而高盐沉淀法通过 SDS(十二烷基硫 酸钠)破坏细胞膜、核膜，使蛋白质变性，从而游离 出来核酸。EDTA能抑制细胞中DNA酶的活性。蛋 白酶K进一步将蛋白质降解成小肽 。加入饱和乙酸 钠后，绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下 变性形成沉淀，而环状mtDNA仍为自 然状态，通过高速离心，除去绝大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质，m tDNA仍在上清中。上述方法都用酚氯仿异戊醇抽提蛋白质、乙 醇沉淀核酸。但均优缺点并存。虽然碱变性法操作 时间较短，但该类方法要求条件比较严格，不易重复。使用Trito n2100将核质分离制备mtDNA法操 作时间短，但产量低，易降解。而高盐沉淀 法操作 简单，易重复，可依需用量扩大反应体系，使 mtDNA质量得以轻松控制。因此，该法具有其它方 法无法比拟的优点。参考文献1胡义德.人白细胞线粒体DNA的快速分离与鉴定.中华血液学杂志,1997; 18(11): 6052戴纪刚.一种简单快速制备动物线粒体DNA的方法.第三军医大学学报,2000; 22(4): 3913伍新尧.分子遗传与基因工程，河南医科大学岀版社.郑州,1997: p374 HymerWC et al. Isolati on of nuclei from m amm alian tissues th rough the use of T ritonX 2100 J H isto l ChemCytochem , 1994: 312(12): 359(2002 206214 收稿)国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期196?国外医学分子生物学分册2003年第25卷第3期#?© 1994-20 0 China AziicmitrPuhli E. A JI ti 吐 LS rtiCirvcil.