植物组织中丙二醛的测定

植物组织中丙二醛的测定一、实验目的和要求1.了解植物叶片衰老过程中丙二醛（MDA）含量变化；2.掌握测定丙二醛（MDA）含量的常用方法。二、实验内容和原理 植物器官在逆境条件下或衰老时，自由基代谢失调，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，通常作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物的最大吸收峰在532nm处，最小吸收峰在600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-1。三、实验材料和主要仪器材料：新老叶蛋白提取液仪器：移液枪，水浴箱，离心机，离心管，分光光度计试剂：磷酸缓冲液，TBA，TCA四、实验方法和步骤1.制取提取液（一周前进行）称叶龄差异明显的叶片各0.50g 左右，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4）离心10min，其上清液即为提取液。2.加试剂以及处理：实验管：分别向1mL新老叶提取液中加TBA与TCA混合液 4.0mL（92ºC水浴保温30min）空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （92ºC水浴30min）3.冷却后，平衡，离心5min（10000rpm）4.测吸光度：测定A532, A450和A600五、实验数据记录和处理由上一次实验可知，新叶质量为0.50g，老叶为0.53g实验数据记录如下：项目 A532值 A450值 A600值新叶 0.147 0.771 0.009老叶 0.244 1.530 0.026数据计算：MDA含量计算公式：MDA(mmol/L)=(A532-A600)/(155*L)，L为比色杯厚度(cm)，此次实验L=1cm。蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA(µmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450进一步可以算出单位鲜重植物组织中的MDA含量。项目 提取液MDA浓度(µmol/L) 鲜叶MDA含量（nmol/g·FW）新叶 0.46 4.58老叶 0.54 5.18六、实验结果分析 实验中测得叶片中丙二醛的含量（消除蔗糖干扰），新叶为4.58nmol/g·FW，老叶为5.18nmol/ g·FW。结果表明，老叶中的丙二醛的含量比新叶多。原因是植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，同时 MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，进一步加剧植物衰老。结果中可以看到新叶中MDA的含量也不低，可能是因为新叶在实验前已放置了一段时间，可能出现了部分组织衰老。七、实验讨论与心得 讨论：1. 第二次离心的目的何在？因为此时已经加入了TBA溶液，并摇匀，且已经过沸水浴加热，上清液中已混有不少杂质，需再次离心才不会干扰显色反应结果。 2. 植物组织中那些物质对丙二醛测定（TBA法）干扰较大？ 定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。另外，植物中的铁离子也会影响丙二醛的测定结果3.激素与衰老的关系 植物内源激素是植物体内微量但具有重要调节作用的生理活性物质。传统的五大激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯都与植物衰老有关。其中细胞分裂素在植物衰老早期起到调节基因的作用；生长素对于植物衰老具有双重效应，低浓度时抑制，高浓度时促进；赤霉素与细胞分裂素协同作用可延缓衰老；一般认为脱落酸和乙烯可加速离体叶片衰老。4.丙二醛对细胞的伤害丙二醛是膜脂过氧化的终产物之一，其含量高低可以作为考察细胞受到胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜脂过氧化，损伤生物膜结构，主要是细胞质膜，使得细胞膜结构和功能上受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。心得：1. 水浴加热时，应在离心管上戳个小孔，防止盖子被水蒸气弹开；2. 吸取上清时应当缓慢吸取，防止吸取时吸入沉淀。3. 低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以可适当向提取液中加铁盐溶液。