蛋白表达及纯化ppt课件

蛋白表达 纯化抗体制备应用及ELISA间接法 1 Part1 蛋白表达 纯化 2 蛋白表达流程 目的基因cDNA表达宿主载体设计引物连接转化诱导表达蛋白纯化鉴定保存 3 gene 4 Cell free Bacterial Yeast Insect Mammalian Host 5 ExpressionSystemCharacteristics 6 一 大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序 共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素 endotoxin 7 Vector 8 二大肠杆菌表达载体的基本组成 一个良好的大肠杆菌表达载体 复制起点 ori 多克隆位点 筛选标记 抗菌素抗性基因 Tag 筛选标记 控制和调节转录与翻译的必不可少的原件 外源基因在原核寄主细胞中表达 它的编码结构必须是连续的 不间断的 处于寄主启动子有效控制下 9 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1 强启动子 外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 30 以上2 应能呈现出一种低限的基础转录水平3 应该是诱导型的 能通过简单的方式 使用廉价的诱导物得以诱导 常用的大肠杆菌表达载体启动子 噬菌体的PL启动子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子色氨酸操纵子trp启动子pBR322质粒的beta 内酰胺酶启动子 启动子 10 终止子 a 如果在克隆基因编码区的3 末端之后 接上一个有效的转录终止子 便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子b 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平 c 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性 大大提高蛋白质产物水平 d 在构建大肠杆菌表达载体时 通常是添加全部终止密码子 阻止核糖体跳跃 skipping 现象 e 大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA 当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下 转译终止效率便会得到进一步加强 11 转译起始序列 a mRNA的5 末端之独特的结构特征 是决定mRNA转译起始效率的主要因素 b 在构建外源基因的高效表达载体时 需认真选择有效的转录起始序列 c 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 KOZAKSEQUENCE 12 筛选标记 其编码产物可被快速测定的功能单元 追踪某些特定的DNA结构 重组质粒 是否已经导入寄主细胞同任何一种目的启动子连接 其表达活性可作为检测启动子功能的依据 半乳糖苷酶基因lacZ荧光素酶基因 luciferase 基因 半乳糖激酶基因 galK 氯霉素抗性 乙酰转移酶 基因 cat 四环素抗性基因 tetr Tag 13 14 15 Xgene 引物的设计 设计一对特异性引物 上游 下游引物引入酶切位点oligo6RNA提取 TRNzol 附件 RT PCR 附件 1 DNAmarker 2 X基因扩增产物图1 1X基因的RT PCR扩增产物 16 Genecloning 1 双酶切目的基因和载体及切胶回收 附件 2 连接转化 附件 3 双酶切鉴定 附件 4 测序 附件 1 DNAmarker 2 重组质粒pET28 X双酶切 3 空质粒pET28a双酶切图1 3重组质粒pET28 X双酶切鉴定 图1 4X基因发生点突变 AGU AGC 但为同义突变 Ser 17 Proteinexpression 检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达 并确定在不同IPTG浓度和时间蛋白诱导效率的差异 挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中 37C振荡培养过夜 8 16h 37C 1mMIPTG终浓度诱导蛋白 取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中 于OD600 0 4 0 6 1 100接种 37C培养时 细菌生长至OD600 0 4 0 6约需2h 时加入终浓度为1mM的IPTG 诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照 按1ml菌液 OD600 100 l的比例 如1mlOD600为0 4的菌加40ulbuffer 加入2 上样缓冲液 混匀 20 保存或直接上样 根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS PAGE胶 50KD蛋白10 或12 诱导3 4h后收集菌液 取1ml样品 测OD600 10000rpm 1min离心去上清后加入相应体积的2 上样缓冲液 vortex 将收集的菌液在水中煮5min 上样10 l 120V电压走浓缩胶 加电压至150V进入分离胶电泳 直到染料刚好走到胶底 取下胶 考马斯亮蓝染色至少30min 染液若是新配的 染20min就够了 脱色液脱色 若急需看到结果 可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带 18 IPTGinduction EvenintheabsenceofIPTG thereissomeexpressionofT7RNApolymerasefromthelacUV5promoter Thedegreeoftoxicitywillvaryfromproteintoprotein pETsystemmanual Novagen 11thEdition 19 1 蛋白marker 2 9 分别用IPTG诱导表达0 1 2 3 4 6 8 12h 图1 6X蛋白表达条件 诱导时间优化 1 0mmol L 2 0 25mmol L 3 0 5mmol L 4 0 75mmol L 5 1 0mmol L 6 1 5mmol L 7 2 5mmol L 8 3 5mmol L 9 5 0mmol L 图1 5X蛋白表达条件 IPTG浓度优化 X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化 20 ProteinPurification Characterizefunction activity structureUseinassaysRaiseantibodiesmanyotherreasons 21 Guidelinesforproteinpurification DefineobjectivesDefinepropertiesoftargetproteinandcriticalcontaminantsMinimizethenumberofstepsUseadifferenttechniqueateachstepDevelopanalyticalassays Adaptedfrom ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC 22 Basicschemeofproteinpurification From ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC 23 Proteinpreparation extraction clarification Cellgrowth proteinover expressionCelllysisRemovalofcelldebris From ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC 24 Proteinisolation concentration andstabilization Reversibleprecipitationwithsaltororganicmolecules From ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC 25 Fractionalprecipitationofproteins AddPrecipitant Centrifugation Chromatography Precipitatecontaminants Precipitateproteinofinterest Discardsupernatant Resuspendprotein Discardpellet AddPrecipitant Centrifugation Discardsupernatant Resuspendprotein 26 IntermediatePurification Liquidchromatography lowerresolution lowercost From ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC 27 Anintroductiontoliquidchromatography ProteinsolutionappliedtoacolumnColumn solidporousmatrix stationaryphase liquid mobilephase ProteinsseparatedbasedondifferinginteractionswithstationaryandmobilephasesMobilephaseconditionscanbeadjustedtoincreaseordecreaseaffinityofproteinforstationaryphase gradient 28 Sizeexclusionchromatography BiggerProteins SmallerProteins 29 AffinityChromatography 30 AffinityChromatography Mostcommonly usedchromatographytechniqueCanbeusedonproteinwithnaturalligandsOfteninvolvescovalentattachmentofaffinitytagtoproteinBecauseofuniquetag providesrapid specificcleanupinonechromatographystep Canallowforautomationofproteinpurification 31 PopularSmallAffinityTags 32 PopularLargeAffinityTags 33 镍柱亲和层析 详细步骤 附件 34 1 空质粒未诱导 2 空质粒IPTG诱导 3 细菌裂解液上清 可溶部分 4 细菌裂解液沉淀 不可溶部分 B 切胶回收1 蛋白marker 2 重组质粒未诱导 3 重组质粒IPTG诱导 4 空白孔 5 纯化重组蛋白 C Ni柱亲和层析 1 8为依次的蛋白过柱洗脱液图1 7X蛋白的可溶性分析 A 和纯化 B C 蛋白纯化结果 1 亲和层析柱2 切胶回收 附件 可溶性蛋白or包涵体纯化 35 Polishingsteps From ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC Liquidchromatography higherresolution highercost 36 Basicschemeofproteinpurification Liquidchromatography higherresolution highercost Liquidchromatography lowerresolution lowercost Reversibleprecipitationwithsaltororganicmolecules Cellgrowth proteinover expressionCelllysisRemovalofcelldebris From ProteinPurificationHandbook AmershamBiosciences 18 1132 29 EditionAC 37 TagRemoval considerations effectonstructureeffectonfunctionflexibilityprotein1 sequence CurrentstrategiesfortheuseofaffinitytagsandtagremovalforthepurificationofrecombinantproteinsProteinExpressionandPurificationVolume48 Issue1 July2006 Pages1 13 38 Proteindetectionmethods SDS PAGEVisualconfirmationWesternblotUVSpectrophotometryAbsorbance 280nmDuemostlytoTrp Protein calculatedwithBeer sLawColorimetricTechniquesColorchangeproportionalto protein Bradford Lowry BCA J S C OlsonandJohnMarkwell CurrentProtocolsinProteinScience 2007 3 4 1 3 4 29 39 Finalstepsinpurification CheckpuritybydetectionmethodsConcentrateyourproteinPrecipitationCentriconsSmallcolumnwithhighbindingcapacityChooseastoragebufferandstorageconditionsConsiderintendeduseofproteinStabilizingadditivesFlashfreezeproteinandstoreat 80oCConfirmidentityofpurifiedproteinMassspectrometrysequencingAnalyticalassays 40 Helpfulreferencesandguides 附件 Protein Expression Protocol 3th docpETsystemmanual Novagen 11thEditionAmershamBiosciences Proteinpurificationhandbook 18 1132 29 EditionAC GotofollowingURLanddownloadpdfofProteinPurificationHandbook AffinityPurification Arnau J Lauritzen C Petersen G E Pedersen J Prot Expr Purif 48 2006 1 13 J S C OlsonandJohnMarkwell CurrentProtocolsinProteinScience 2007 3 4 1 3 4 29 41 Part2 抗体制备 应用 42 单抗制备多抗制备 附件抗体鉴定 效价特异性 43 PrincipleofMcAbProduction 44 抗原经FCA或FIA充分乳化后免疫家兔 首次免疫佐剂用FCA 第二 三次用FIA 家兔脊柱两旁选5点皮下注射 每点注摄0 2ml 间隔后2周选不同点注射 每次免疫的抗原量约350 g 兔 第三次免疫后10天 耳动脉取血检测抗体效价 双相琼脂扩散实验效价至少达到1 16 ELISA效价达到105即可放血 最后一次取血采用颈动脉放血 新西兰兔 附件 45 图1 9兔多克隆抗体效价测定 琼脂糖凝胶免疫扩散试验 图1 10兔血清抗体效价曲线 ELISA 多抗效价测定 琼脂糖凝胶免疫扩散试验 附件 2 ELISA 附件 46 1 4 各孔上样量分别为69ug 138ug 230ug和920ug菌体蛋白图1 11兔多克隆抗体特异性鉴定 绿色 FITC anti rabbitIgGantibody蓝色 Hochest33258图1 12兔多克隆抗体免疫荧光检测 1000 多抗特异性鉴定和应用 Westernblot 2 Immunofluorescencetechnique 47 Part3 ELISA间接法检测血清抗体浓度 48 X ELISA检测原理 间接法 49 NS1 ELISA法检测步骤 1 抗原包板 纯化抗原1 100包被液稀释 2ug ml 4 过夜 PBS洗3次 2 封闭 2 5 脱脂奶粉封闭1h 3 一抗反应 小鼠血清1 10稀释 封闭液 100ul 孔 4 过夜 PBS洗3次 2 二抗反应 加入100ul用稀释液1 500稀释的酶标抗体 37 1h后1 洗涤缓冲液冲洗三次 3 显色 每孔加底物溶液100ul显色 A与B1 1混合 置室温10min左右 可根据显色情况而定 4 终止 每孔加终止液50ul 5 结果判定 选波长450nm 空白孔校零 用酶联免疫检测仪对每孔进行比色 并记录其OD450值 样品孔OD值 阴性对照孔 平均值 2 1时 该孔样品为阳性 反之为阴性 50 小鼠血清抗体水平 51 谢谢 52