转录和转录组学transcriptome.ppt

转录和转录组学ThanscriptionandTranscriptomics 吕社民 M D Ph D 西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系电话 82657764Email lushemin Replication Replication Transcription ReverseTranscription Translation 中心法则 thecentraldogma TheRoyalSwedishAcademyofScienceshasdecidedtoawardtheNobelPrizeinChemistryfor2006toRogerD KornbergStanfordUniversity CA USA forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription RogerD Kornberg born1947 59 inStLouis MO USA UScitizen PhDfromStanfordUniversity CA USA Mrs GeorgeA WinzerProfessorinMedicineatStanfordUniversitySchoolofMedicine CA USA OriginalscientificarticlesCramer P Bushnell D A andKornberg R D 2001 Structuralbasisoftranscription RNApolymeraseIIat2 8 ngstromresolution Science292 1863 1876 Gnatt A L Cramer P Fu J Bushnell D A andKornberg R D 2001 Structuralbasisoftranscription AnRNApolymeraseIIelongationcomplexat3 3 resolution Science292 1876 1882 Bushnell D A Westover K D Davis R E andKornberg R D 2004 Structuralbasisoftranscription AnRNApolymeraseII TFIIBcocrystalat4 5angstroms Science303 983 988 ReviewarticleBoeger H Bushnell D A Davis R Griesenbeck J Lorch Y Strattan J S Westover K D andKornberg R D 2005 Structuralbasisofeukaryoticgenetranscription FEBSLett 579 899 903 b 1918 TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959 fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid 2006年诺贝氏生理医学奖得主Dr FireAandDrMelloC 主要内容 一 核糖核酸的类型 结构和功能二 RNA的合成三 真核细胞转录后修饰四 转录水平的基因表达调控五 RNA分析六 转录组学 一 核糖核酸的类型 结构和功能 类型编码蛋白质 编码RNA和非编码RNA功能 rRNA tRNA mRNA小RNA snRNA snoRNA scRNA 2 核糖核酸的结构和功能 4种核苷糖以磷酸二酯键连接的长链 A U C G 戊糖是核糖 2 1mRNA2 1 1 原核生物mRNA结构的特点 1 多顺反子 2 mRNA5 端无帽子结构 3 端无多聚A尾 3 mRNA一般没有修饰碱基 2 2 2 真核生物mRNA结构的特点 1 5 端有帽子结构 2 大多3 端有多聚A尾 3 分子中可能有修饰碱基 主要有甲化 4 分子中有编码区与非编码区 2 2tRNA1 单链小分子 2 含有稀有碱基或修饰碱基 3 5 端总是磷酸化 5 末端往往是pG 4 3 端是CpCpAoH序列 5 三叶草结构 6 三级结构是倒L型 三级结构呈倒L形 2 3rRNA 原核生物 70S 由50S和30S组成真核生物 80S 由60S和40S组成 2 4核酶 分三类 异体催化的剪切型 自体催化的剪切型 内含子的自我剪接型 二级结构 锤头结构 13 或11 个保守核苷酸 核酶的发现1982年Cech在研究低等真核生物四膜虫的rRNA加工成熟过程中发现其rRNA前体有自我剪接作用 即酶的作用 故把有催化活性的RNA称核酶 底物部分含GU 催化部分包括3个茎 1 3个环 含13b保守序列CAAA AC AGUC GUG 核苷酸链断裂点 槌头状结构 最简单的核酶 核酶的意义 动摇了酶是蛋白质的传统概念 为地球上生命起源早期可能是先出现RNA提供证据 为人工合成核酶以破坏某些病原微生物 消除体内有害基因提供理论基础 2 5核内不均一RNA hnRNA 真核细胞mRNA的前体加工过程 5 端加帽 3 端加尾 内含子的切除和外显子的拼接 甲基化修饰 核苷酸序列的编辑作用 2 6小分子核内RNA snRNA 尿嘧啶含量较高 用U命名 U1 U10 U1 U2 U4 U5 U6位于核浆内U3存在于核仁U7 U8 U9 U10只存在于哺乳动物2 7反义RNA 可与mRNA形成双链 抑制翻译 2 8microRNA调节mRNA的水平 二 RNA的合成 转录 transcription 指在RNA聚合酶催化下 以DNA为模板 NTP为原料 合成RNA的过程 转录概述 DNA为模板合成RNA的过程RNA聚合酶原料 ATP UTP CTP GTP NTP Mg2 Mn2 合成方向 5 3 连接方式 3 5 磷酸二酯键 1 1转录模板 模板链 templatestrand 也称反意义链 antisensestrand 链或Watson链 即指导转录生成RNA的一股DNA单链 1 原核生物RNA的合成 编码链 codingstrand 也称有意义链 sensestrand 或Crick链 指不被转录的DNA单链 其碱基序列除有T无U外 与转录产物RNA相同 5 GCAGTACATGTC 3 3 cgtcatgtacag 5 5 GCAGUACAUGUC 3 N Ala Val His Val C DNA RNA 肽 转录 翻译 编码链 模板链 5 3 5 3 5 5 不对称转录 结构基因 能转录出RNA的DNA区段 不对称转录 asymmetrictranscription DNA片段 结构基因 转录时 双链DNA中只有一条链作为转录的模板 且模板链并非总在同一条单链上 这种转录方式称为不对称转录 1 2原核生物RNA聚合酶 DNA dependentRNApolymerase RNA pol DDRP 1种 1 2 1 组成全酶 2 核心酶 核心酶 2 1 2 2 作用 亚基 决定那些基因被转录 亚基 催化与模板配对的相邻NTP以3 5 磷酸二酯键相连 亚基 促进酶与模板链结合 并使DNA双链打开 核心酶 催化RNA链的延长 参与整个过程 亚基 辨认转录起始位点 并与核心酶结合成全酶启动转录 70 辨认一般转录起始点 32 辨认原核生物热休克基因 hsp 的转录起始点 1 2 3 特点 聚合速率慢 30 50NTP s 无外切酶活性 无校对功能 错误率10 6 亚基可被利福平 利福霉素结合 抑制 原核生物的RNA聚合酶全酶及其在转录起始区的结合DNA双链以打开 因子尚未脱落 35 TTGACA TATAAT 20 1 1 3 模板与酶的辨认结合 启动子 promoter 转录开始进行时 RNA聚合酶与模板结合的特定部位 也是调控转录的关键部位 原核生物启动子结构 识别部位 35bp区 TTGACA 因子识别此部位 结合部位 10bp区 Pribnowbox TATAAT Tm低 DNA易解链 转录起始点 startsite 以 1表示 RNApol保护区 结构基因 终止点 1 1 4 原核生物的转录过程 识别起始位点 RNApol全酶解开双链DNA10 20bp形成转录空泡 1 4 1 转录起始 原核生物的RNA聚合酶全酶及其在转录起始区的结合DNA双链以打开 因子尚未脱落 35 TTGACA TATAAT 20 1 全酶催化与模板配对结合的头两个NTP GTP多见 或ATP 以磷酸二酯键相连成5 pppGpN OH3 转录泡变为转录起始复合物 RNApol 2 DNA pppGpN OH 因子脱落 核心酶变构 与模板链结合变松 沿DNA滑动 1 4 2 转录延长 核心酶沿模板链3 5 滑动 催化与模板碱基配对结合的相邻NTP之间以磷酸二酯键相连 RNA链沿5 3 延长 转录泡随核心酶滑动而移动 生成的RNA与DNA模板形成约12bp杂化双链 过长的RNA脱离模板链 伸出转录泡外 1 4 3 转录终止 转录到终止信号时 酶停止滑动 转录终止 终止信号 terminator DNA特定部位富含GC回文区与富含AT配对区 转录后使mRNA形成发卡结构 以终止转录 蛋白辅助识别终止信号 参与终止 1 非依赖 因子的终止GC区形成发卡结构 聚U区配对不稳定 使RNA释放 5 5 2 依赖 因子的终止 沿RNA链5 3 滑动的 因子追上RNApol 并与RNA中富C区结合 诱导RNA聚合酶构象改变 因子的解螺旋酶活性使RNA释放 富C polymerase polymerase 2 2 真核生物RNA的生物合成 2 2 1真核生物RNA聚合酶 2 2 2 真核生物启动子结构 以RNApol 为例 识别部位 70区CAAT盒结合部位 25区TATAbox Hognessbox CAAT上游的GC盒含增强子 enhancer 和静息子 silencer 1 增强子 静息子 基础表达 启动子 结构基因 25 70 顺式作用元件 cis actingelement 转录上游区与转录相关的具有调控作用DNA序列 反式作用因子 trans actingfactor 能直接或间接辨认 结合转录上游区段DNA的蛋白质 转录因子 transcriptionalfactor TF 能直接或间接结合RNApol的反式作用因子 起始 复杂DNA在开链前 需多种转录因子 TF 结合后 RNApol 加入形成转录起始前复合物 pre initiationcomplex PIC 2 2 3 真核生物转录的特点 TF DTF ATF Bpol TF FTF ETATAPIC TATA A D B F DNA RNApol E H TFIIH 延长 除转录和翻译是两个时空进行外 与原核生物大致相似 终止 mRNA3 端转录出AAUAAA及富GU序列后 在AAUAAA后约11 13b的修饰点 processing 被切断 游离的mRNA戴帽 加尾 螺旋酶使在AAUAAA后继续转录出的RNA脱离模板链 转录终止 RNApol 脱落 该RNA被RNase水解 AAUAAA GUGUGUG 5 AAUAAA ployA 真核生物的转录终止 1 3 2 3 processing GUGUGUG 解螺旋酶 核酸酶 1 mRNA前体的加工 hnRNA 核内不均一RNA mRNA前体经加工修饰后成为成熟的mRNA 三 真核生物的转录后修饰 1 1 5 末端加帽 核内 5 末端帽子m7GpppG的生成 G 功能 稳定mRNA结构给核蛋白体提供识别信号 1 2 3 末端加尾 核内 转录终止时在修饰点切除多余的RNA 在polyA聚合酶催化下 以ATP为原料在修饰点后逐个加上AMP形成polyA尾 100 200b 功能 维持了mRNA的活性稳定mRNA结构参与mRNA由核进入胞浆 断裂基因 splitegene 真核生物的结构基因 编码序列 中插入若干非编码序列而被隔开 故称断裂基因 1 3 剪接 splicing 核内 hnRNA hetero nuclearRNA 杂化核RNA mRNA的前体 核内出现的mRNA的初级转录产物 成熟mRNA与基因DNA杂交电镜所见 1043 185 51 129 118 143 156 外显子 exon 在断裂基因及其初级转录产物上出现 并表达为成熟RNA的核酸序列 内含子 intron 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列 内含子的分类 按基因类型和剪接方式分为4种I II类 自身剪接 线粒体 叶绿体 rRNA mRNA III类 形成套索结构后剪接 mRNA IV类 剪接需酶和ATP tRNA 按基因线性表达分为翻译前切除 翻译绕过 翻译后切除3种 剪接方式 内含子的功能 利于物种的进化选择基因表达的调控 剪接 hnRNA剪切内含子 拼接外显子 连接为成熟mRNA的过程 剪接部位为内含子末端的特定序列5 GU AG 3 套索的形成及剪除机制 二次磷酸酯转移 snRNA smallnuclearRNA 100 300bp的核内小RNA 已发现U1 U2 U4 U5 U6剪接体 snRNA和核内蛋白质构成的小分子核糖核蛋白体 snRNP 能结合hnRNA内含子区段 使内含子弯曲 3 和5 靠近 利于剪接 1 4 甲基化 甲基化发生在剪接之前 在非编码区分子含1 2个m6A 1 5 RNA编辑 RNAediting 遗传信息在mRNA水平上的改变过程 称为RNA编辑 某些mRNA的核苷酸序列 在生成转录产物后还需插入 删除或取代一些核苷酸残基 方能生成具有正确翻译功能的模板 apoBmRNA的编辑加工 5 末端加帽 3 末端加尾 剪切内含子 拼接外显子 剪接 hnRNA mRNA 修饰 编辑 小结 2 tRNA的转录后加工 串联tRNA初级转录产物由RNaseP从tRNA单体的5 端切下单个tRNA RNA内切核酸酶切除反密码环前身中内含子 连接酶连接反密码环 RNaseD从3 切下几个核苷酸 核苷酸转移酶催化3 末端加上 CCA OH 甲基化 A mA G mG 甲基转移酶 还原 形成DHU环异构 U 脱氨 A I 3 rRNA的转录后加工 3 1 特点rDNA为高度重复序列 真核生物初级转录产物为45SrRNA的串联rRNA 原核 5 107个拷贝真核 果蝇260个拷贝 3 2 过程 RNA内切酶 多种 切下45SrRNA的单位 甲基化后切成18S 5 8S和28SrRNA 5SrRNA由RNApol 从rDNA外转录出 无成熟过程 四 转录水平的基因表达调控 基因表达 geneexpression 是指基因组中结构基因经过转录 翻译等过程 合成蛋白质 进而发挥其特定的生物学功能的全过程 RNA的合成 4种NTP DNA模板 RNA聚合酶转录单位 结构基因 启动子 终止子按碱基配对原则 沿5 3 方向真核生物有三型RNA聚合酶分为起始阶段 延长阶级和终止阶段转录后的产物经加工成为成熟的RNA 蛋白质的合成 合成体系 氨基酸 mRNA tRNA 核糖体 某些酶与蛋白质因子 ATP GTP MgmRNA编码区的三个相邻核苷酸组成密码子tRNA起接合器作用 核糖体是合成场所和装配机核糖体循环 起始 肽链延长和终止翻译后加工 折叠 共价修饰 水解和亚单位的聚合 基因表达及其调控的特点 管家基因 housekeepinggene 在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因 组成性基因表达 constitutivegeneexpression 管家基因的表达方式 较少受环境影响 在个体各生长阶段的几乎全部组织中持续表达或变化很小 诱导表达 inductionexpression 有一些基因表达极易受环境影响 在特定环境信号刺激下 基因的表达开放或增强 阻遏表达 repressionexpression 在特定环境信号刺激下 基因的表达关闭或减弱 时间特异性 temporalspecificity 在多细胞生物 从受精卵到组织 器官形成的各个发育阶段 相应的基因严格按照一定的时间顺序开启或关闭 空间特异性 spatialspecificity 在个体生长全过程 某基因产物在不同组织空间顺序出现 协调表达 coordinatedexpression 功能相关的一组基因 协调一致 共同表达 又称协调调节 coordinatedregulation 基因表达的调控 geneexpressionregulation 是指各种细胞中相同的遗传信息 有规律的选择性 程序性 适度的表达以适应机体生长 发育 繁殖以及环境变化的需要 发挥其生理功能的调节和控制 基因表达调控的生理意义 适应环境 维持生长和增殖维持个体发育与分化 基因表达调控的基本原理 基因表达的多级调控基因转录激活调节基本因素特异DNA序列调节蛋白DNA 蛋白质 蛋白质 蛋白质相互作用RNA聚合酶 Transcription 5 GATCTGACTGACATAGACATAGAT3 coding non template strand3 CTAGACTGACTGTATCTGTATCTA5 templatestrand5 GAUCUGACUGACAUAGACAUAGAU3 mRNA 4 1 原核生物基因表达的调控 4 1 1转录水平的调控影响转录的因素 启动子 因子阻遏蛋白正调控蛋白倒位蛋白RNA聚合酶抑制物衰减子 操纵子 operon 调控区 信息区 启动子 操纵基因 启动子 决定转录方向及模板链 E coli的启动子长约40 60bp 至少包括三个功能区 起始部位 initiationsite 1结合部位 bindingsite 10bp RNA聚合酶与之结合T80A95T45A60A50T96识别部位 recognitionsite 35bp 因子与之结合T82G78A65C54A95 因子 不同的因子 可以竞争性的结合RNA聚合酶 环境变化可由到产生特定的 因子 从而打开一套特定的基因 阻遏蛋白 repressor 与DNA结合后都是抑制转录 这种基因表达调控的方式称为负调控 正调控蛋白 与DNA结合后促进转录 这种基因表达调控的方式称为正调控 CAP蛋白 catabolicgeneactivatorprotein CAP 分解代谢物基因活化蛋白ntrC蛋白是大肠杆菌氮代谢基因激活蛋白 其自身活性可通过ntrB使其磷酸化 有活性 和去磷酸化 无活性 而被调节 consensus TATA Pribnow box E coliPromoters 倒位蛋白 inversionprotein 是一种位点特异的重组酶 沙门菌H1和H2鞭毛蛋白分别由两个基因编码 在一个细菌克隆中以表达一种鞭毛抗原为主 衰减子 attenuator 又称弱化子 位于操纵子中第一个结构基因之前 是一段能减弱转录作用的序列 RNA聚合酶抑制物 细菌在缺乏氨基酸的环境中 RNA聚合酶活性降低 RNA rRNA tRNA 合成减少或停止这种现象称为严谨反应 stringentresponse Positivevs NegativeRegulation AllostericEffectors Bindingcanalsoberequiredforbindingofrepressor e g Trp orcanblockanactivator 4 1 2 转录的调控机制 乳糖操纵子调控的机制阿拉伯糖操纵子的调控机制色氨酸操纵子的调控机制 乳糖操纵子 lacoperon 结构特点三个结构基因Z Y A 分别编码 半乳糖苷酶 galactosidase 透酶 permease 和半乳糖苷乙酰化酶 galactosideacetylase 其上游还有一个启动子 P 和一个操纵基因 O 启动子上游还有一个CAP蛋白结合位点 OrganizationofLacOperonandLacI promoter RegulationofGeneExpression 异丙基硫代半乳糖苷 半乳糖 AdenylatecyclaseandCAPmediateglucoserepressionofLac Adenylatecyclase AC isanenzymethatsynthesizescyclicAMP cAMP fromATP Highglucose adenylatecyclaseisinhibited indirectly viaacatabolicproduct ThereforecAMPlevelsareLOW Absenceofglucose adenylatecyclaseisNOTrepressedThereforecAMPlevelsareHIGH cAMPformsacomplexwiththeCAPprotein whichallowsittothenbindtotheCAPsiteupstreamoftheLacoperon BindingoftheCAPproteinisrequiredtoallowRNApolymerasetobindtothelacpromoterandturnontranscription IntheabsenceofCAPbinding thereisno orverylittle transcriptionofthelactoseoperon eveninthepresenceoflactose CAPBindingBendsDNAv ThisDNAbendingresultsinmoreefficientRNApolymerasebinding CAPmediatesglucoserepressionofLac Promotestranscription 调控机制 I基因编码产生阻遏蛋白 阻遏蛋白为四聚体 在没有乳糖的条件下 阻遏基因与操纵基因结合 当有乳糖存在时 经透酶作用进入细胞 在 半乳糖苷酶催化下转变成半乳糖 后者作为诱导剂 inducer 与阻遏蛋白结合 使阻遏蛋白与操纵基因解聚 结构基因转录 LactoseGlucose LacI CAP cAMP FourStatesoftheLacOperon 阿拉伯糖操纵子 araoperon 结构特点结构基因B A D 分别编码异构酶 isomerase 激酶 kinase 表位酶 epimerase 催化阿拉伯糖转变为5 磷酸木酮糖调控区由启动子 P 起始区 I 和操纵基因 O 构成 CAP 调控机制 C基因是调节基因 编码调控蛋白AraC AraC蛋白单独存在时 结合到araO1和araO2 表现出负调控 阿拉伯糖使AraC蛋白变构 结合到araI上 表现正调控 在ara操纵子基因表达调控中 CAP蛋白的调控作用不显著 TheArabinoseOperon ThislooppreventsRNAtranscription NOTtrueforallloops NoArabinosepresent operonOFF Arabinosepresent Glucoseabsent operonON 调控作用 有葡萄糖 有或无阿拉伯糖 关闭无葡萄糖 无阿拉伯糖 关闭无葡萄糖 有阿拉伯糖 开放 色氨酸操纵子 trpoperon 结构特点E coli的色氨酸操纵子有五个结构基因E D C B A基因编码三种酶 用于合成色氨酸 上游调控区由启动子 P 和操纵基因 O 组成R基因编码阻遏蛋白 GenomicOrganizationoftheTrpOperon 调控机制 阻遏型操纵子及衰减机制 衰减子位于结构基因E和操纵基因O之间的L基因中 L基因的部分转录产物编码14个氨基酸 其中含两个相邻的色氨酸密码子 这两个相邻的色氨酸密码子及原核生物中转录和翻译的偶联是产生衰减的基础 调控作用将环境中的色氨酸消耗完 然后开始自身合成 ControlofGeneExpressionintheTrpOperon TheenzymecatalyzingthefirststepinthepathwayisinhibitedbyTrp feedbackcontrol InthepresenceofTrp arepressorproteinbindstoanoperatorupstreamoftheTrpoperonandshutsofftranscriptionAttenuation Thereisa160basepairregionintheTrpmRNAthatcausestranscriptiontoterminateprematurelyifTrpispresent TrranscriptionalControl AttenuationControl 4 1 2 翻译水平的调控 SD序列 Shine Dalgarnosequence 原核细胞多顺反子mRNA上的一段序列 位于起始密码子上游SD序列与起始密码子的距离 蛋白质对SD序列的作用 影响翻译的起始mRNA二级结构隐蔽SD序列的作用 mRNA的稳定性mRNA的降解速度是翻译调控的一个重要因素mRNA的稳定与其序列和结构 即一级结构与次级结构 有关 翻译产物对自身翻译的影响核糖体蛋白50种蛋白质分布于不同操纵子各自编码一种可结合于mRNA多顺反子上游特定部位的蛋白质 阻止核蛋白体结合翻译终止因子RF2调节自身的翻译前25个密码子与后315个密码子间的UGAC在无RF2时框移 小分子RNA的调控作用调整基因表达产物的类型mRNA干扰性互补RNA mRNAinterferingcomplementaryRNA micRNA 低水平表达基因的调控小分子RNA阻遏物在翻译水平严格控制低水平基因表达 4 2 真核基因的表达调控 4 2 1 DNA水平的调控 染色质丢失低等生物及动物红细胞 不可逆基因扩增基因重排基因片段改变原衔接顺序 重排为完整的转录单位 DNA甲基化与基因的表达成反比关系直接改变基因的构型影响转录因子与顺式作用元件结合5 端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白结合DNase 高敏感区为去甲基化的标志染色质结构改变组蛋白与DNA结合与解离非组蛋白与组蛋白竞争结合DNA 解除组蛋白对基因表达的抑制 4 2 2 转录水平的调控 转录起始复合物的形成 真核生物的RNA聚合酶识别的不是单纯的DNA序列 而是由一个通用转录因子 transcriptionfactor TF 与DNA形成的蛋白质 DNA复合物TFIID结合TATA盒RNA聚合酶结合TF D 形成闭合的复合物其它TF与RNA聚合酶形成开放的复合物 反式作用因子 真核细胞内序列特异的DNA 8 15bp 结合蛋白可以使基因开放 正调控 或关闭 负调控 三个功能结构域 DNA结合域 转录活性域 结合其它蛋白结构域 DNAStructure MajorandMinorGrooves DNA结合域 DNA bindingdomain 锌指结构 Zincfingermotif 同源结构域 Homodomain 亮氨酸拉链 Leucinezipper 螺旋 环 螺旋 Helix loop helixstructure 碱性 螺旋 Alkaline helix ZincFingerMotif Helix Turn HelixMotif LeucineZipper LeucineZipper Zipper every7thresidueisaLeu Hydrophobicinterface H BondinginaProtein DNAInteraction 转录活化结构域 transcriptionalactivationdomain 酸性 螺旋结构域 acidic helixdomain 富含谷氨酰胺结构域 glutamine richdomain 富含脯氨酸结构域 proline richdomain 4 2 3 转录起始的调控 反式作用因子的活性调节表达式调节合成后即有活性 不能积累共价修饰磷酸化 去磷酸化 糖基化配体结合激素受体蛋白质与蛋白质相互作用复合物的解离与形成 反式作用因子与顺式元件的结合反式作用因子的作用方式成环扭曲滑动Oozing反式作用因子的组合式调控作用组合式基因调控 conbinatorialgeneregulation 几种反式作用因子组合而发挥特定作用 4 2 4 转录后水平的调控 加帽和加尾的调控意义选择剪接的调控作用选择剪接 alternativesplicing exon intron是否出现在成熟mRNA是可以选择的Exon选择 intron选择 互斥exon 内部剪接位点mRNA运输的控制 4 2 5 翻译水平的调控 翻译起始的调控阻遏蛋白的调控作用翻译起始因子的功能调控AUG对翻译的调控mRNA5 非编码区长度对翻译的影响mRNA稳定性调节小分子RNA对翻译水平的影响 4 2 6 翻译后水平的调控 新生肽链的水解肽链中氨基酸残基的修饰通过信号肽分拣 运输 定位 4 2 7 组织特异性表达和时相性 Spatialrestrictionofgeneexpression c p housekeepinggenes Multipleorgan tissuepattern e g SHHinnervoussystem Specifictissur celllineageorcelltype e g beta globingeneinerythroidcells Individualcells e g BCR TCR Intracellulardistribution TemporalrestrictionofgeneexpressionCellcyclestage Developmentalstage e g globingene Differentiationstage Collagengenes Inducibleexpression 五 RNA分析 1 Northern印迹 核酸杂交 不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列 在一起复性时 互补序列配对 形成杂化分子 2 狭缝印迹法 3 组织原位杂交 4 RNase保护测定法 5 mRNA引物延伸分析 6 应用单链DNA探针的S1定位法 7 设置内参的RT PCR 内参基因 beta actin GAPDH rRNARNA制备 逆转录 PCR 凝胶电泳 定量测定 8 实时定量PCR 六 转录组学 transcriptomics GlobalmRNAprofiling 不同组织或细胞中基因转录的总体特征 不同组织或细胞在不同时间基因的转录有数量和表达程度的差异 基因表达模式提供单一基因辅助信息和其它基因的联系 确定基因和产物的功能途径和网络 有利于新药的发展 技术具备 1 cDNA微阵列 2 差异显示PCR DDRT PCR 3 端引物为T 11 MN5 端引物为10个碱基组成的随机引物分离总RNA后 行RT PCR电泳 比较差异 3 基因表达序列分析术 seriesanalysisofgeneexpression SAGE 9 10bp短核苷酸序列 含有鉴定一个转录物的足移信息 9bp克隆测序 分析结果 Massivelyparallelsignaturesequencing MPSS 5 代表性差异分析 RDA PCR 6 抑制性消减杂交 SSH 随机cDNA文库8 EST数据库比对 RNA常用检测方法比较 分辩率高 通量低Tissueandcellularinsituhybridization分辩率低 通量低NorthernblottingDotblottingRT PCRRibonucleaseprotectionassay分辩率低 通量高DNAmicroarrayDDRT PCRSSHSAGE 主要参考文献 冯作化主编 医学分子生物学 人民卫生出版社 2001 刘德培主编 医学分子生物学 人民卫生出版社 2003 冯作化主编 医学分子生物学 人民卫生出版社 2005 BrownTA Genomes2 JoneWiley Sons InC 2002StrachanTandReadAP HumanMolecularGenetics3 GarlandPublishing 2004 致谢 本幻灯片采用了西交大医学院遗传学与分子生物学系部分老师的ppt内容 没有一一标名 对他们付出的勤劳表示感谢 谢谢