13第七章原生质体的分离和培养

第七章第七章 原生质体的分离和培养原生质体的分离和培养原生质体原生质体:是指植物细胞中除去细胞的壁的裸露部分是指植物细胞中除去细胞的壁的裸露部分.特点特点:1.有全套的遗传信息有全套的遗传信息-可完成全能性可完成全能性:2.同一时间获得遗传上的同质体同一时间获得遗传上的同质体3.实现远缘杂交实现远缘杂交;4.摄取外源摄取外源DNA细胞器等细胞器等-遗传转化的理想实体遗传转化的理想实体.一一,原生质体的分离原生质体的分离除去胞间层除去胞间层(粘着粘着)-单细胞单细胞-除去细胞壁除去细胞壁酶解法酶解法:漆斑霉产生的纤维素酶漆斑霉产生的纤维素酶(粗制剂粗制剂)-分离番茄根尖分离番茄根尖 细胞原生质体细胞原生质体缺点缺点:可能受到酶的影响可能受到酶的影响首先首先:产量高产量高,活性强活性强,能分裂能分裂,产生愈伤组织产生愈伤组织(胚状体胚状体)最终最终.形成完整植株的原生质形成完整植株的原生质影响因素影响因素取材取材酶的种类酶的种类酶的渗透酶的渗透压压原生质膜的稳定剂原生质膜的稳定剂酶解的时间、温度、纯化方法等酶解的时间、温度、纯化方法等分离分离:1.表面消毒表面消毒:苄烷铵苄烷铵0.1%+酒精酒精10%-5min60%70%酒精消毒酒精消毒30s-0.1%HgCl2-无菌水冲洗无菌水冲洗35次次2.酶解酶解:撕去叶片下表皮撕去叶片下表皮(向下向下)-漂浮于酶液中漂浮于酶液中-真空泵处理真空泵处理35分钟分钟(2h后后)分离出原生质体分离出原生质体3.酶酶纤维素酶纤维素酶:消化细胞壁纤维素消化细胞壁纤维素果胶酶果胶酶:降解中胶层降解中胶层半纤维酶半纤维酶酶的选择酶的选择:愈伤组织、悬浮细胞愈伤组织、悬浮细胞-浓度大浓度大 活动强的酶活动强的酶叶片叶片,浓度小浓度小4.条件条件: 黑暗黑暗静止静止 轻摇轻摇时间时间:几几几十小时几十小时温度温度 250C(一一).原生质体供体原生质体供体1.取自植物体取自植物体,多以叶片为主多以叶片为主易获得易获得酶处理简便酶处理简便短时间可获得大量原生质体短时间可获得大量原生质体继代培养保持胚性状态继代培养保持胚性状态,利于获得原生质体利于获得原生质体材料类型材料类型:天然天然:田间田间:野生、温室、盆栽野生、温室、盆栽人工材料人工材料:愈伤组织、悬浮、自制培养再生植愈伤组织、悬浮、自制培养再生植 物、试管苗物、试管苗(2)注意事项注意事项:a.选择具有形态分化潜力的材料选择具有形态分化潜力的材料;b.选择酶处理后的大量原生质材料选择酶处理后的大量原生质材料;c.选择稳定性好选择稳定性好,不易破碎不易破碎;d.选择活性高选择活性高,可持续分裂可持续分裂c.选择合适的基因型选择合适的基因型(关键关键)(2).材料的特性和生理状态材料的特性和生理状态a.幼嫩叶片幼嫩叶片(天然天然);b.45d无菌苗下胚轴无菌苗下胚轴;d.未成熟种子胚的子叶未成熟种子胚的子叶;e.禾本科植物、幼胚、幼穗、花药禾本科植物、幼胚、幼穗、花药外植体来源的愈伤组织外植体来源的愈伤组织:优点优点a.幼嫩材料不受外界环境的影响幼嫩材料不受外界环境的影响;b.实验的重复性好实验的重复性好;c.原生质体的产量、活性及稳定性好原生质体的产量、活性及稳定性好d.可原生质的分化潜力做出初步估价可原生质的分化潜力做出初步估价.(二二).分离原生质体所用的酶类分离原生质体所用的酶类1.酶的类型酶的类型纤维素酶类纤维素酶类果胶酶类果胶酶类半纤维素酶类半纤维素酶类都含有酚类、核酸酶、蛋白酶过氧化物酶杂质都含有酚类、核酸酶、蛋白酶过氧化物酶杂质具一定毒性具一定毒性2.酶的处理酶的处理凝胶柱过滤凝胶柱过滤-酶液脱盐纯化酶液脱盐纯化3.影响因素影响因素*酶的活性与酶的活性与pH有关有关 4.76.0*温度温度 4050OC 最适温度最适温度 原生质原生质 25300C时间时间 30min-20h4.木、草本植物使用时间不同木、草本植物使用时间不同5.时间时间 424h 1g材料材料+10ml二二 原生质的培养原生质的培养1.过程过程:原生质原生质-细胞再生细胞再生-细胞分裂细胞分裂-细胞团芽和根细胞团芽和根2.培养方法培养方法细胞植板法细胞植板法半固体培养基半固体培养基琼脂糖琼脂糖优点优点:位置固定位置固定,方便观察方便观察多用液体培养基多用液体培养基:琼脂上细胞不易分裂琼脂上细胞不易分裂可降低渗透压可降低渗透压可更换培养基可更换培养基可降低细胞密度可降低细胞密度(一一).原生质体活性试验原生质体活性试验1.方法方法:A.以胞质环流作为代谢活跃进行的指标以胞质环流作为代谢活跃进行的指标;B.以氧的摄入量做指标以氧的摄入量做指标,可通过指示呼吸代谢强度的氧电极可通过指示呼吸代谢强度的氧电极 进行测定进行测定;C.以光合活性做指标以光合活性做指标.D以完整的质膜排斥伊月蓝的能力做指标以完整的质膜排斥伊月蓝的能力做指标.E.以二乙酸荧光素的染色能力为指标以二乙酸荧光素的染色能力为指标荧光素双醋酸酯荧光素双醋酸酯(FDA)染色法染色法有活性有活性:有内酯酶分解有内酯酶分解,分解分解-有荧光产生有荧光产生无活性无活性:无内酯酶无内酯酶,无荧光产生无荧光产生方法方法:(1)原生质悬浮液原生质悬浮液0.5ml,置于置于10mm100mm的小的小 管中管中;(2).加入贮于加入贮于00C,含含2mg/L的的 FDA的丙酮溶液成的丙酮溶液成质量分数为质量分数为0.01%,混匀混匀;(3).置于室温下置于室温下5min后后用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察有活力有活力: 荧光荧光无活力无活力:无荧光无荧光用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察有细胞壁有细胞壁 绿色荧光绿色荧光无细胞壁无细胞壁:红色红色(二二).培养基培养基2.检测细胞壁是否除净荧光增白剂检测细胞壁是否除净荧光增白剂 将纯化后收集的原生质加入将纯化后收集的原生质加入0.1%-0.05%的荧光增的荧光增白剂白剂,染色染色510min.离心离心3min,再用再用0,7mol/L甘露洗去甘露洗去多余染料多余染料,如此重复如此重复3次次.1.营养成分营养成分无机盐无机盐有机物有机物激素激素条件培养基条件培养基:将生长迅速的细胞在液体培养基中培将生长迅速的细胞在液体培养基中培 养一段时间养一段时间,除去细胞后收集的培养基除去细胞后收集的培养基.Ph值值 5.65.82.原生质体的培养方法原生质体的培养方法(1)液体培养液体培养液体浅层培养液体浅层培养微滴培养微滴培养操作简便操作简便,伤害小伤害小分布不均匀分布不均匀多组合、单个融合多组合、单个融合分布不均匀、易挥发分布不均匀、易挥发(2).固体培养固体培养-琼脂包埋琼脂包埋300C琼脂糖琼脂糖+原生质原生质-培养皿底部培养皿底部优点优点:提高植板效率提高植板效率 便于观察便于观察 易于统计易于统计缺点缺点:操作要求严格操作要求严格(3)液液固体结合培养固体结合培养A.液体浅层液体浅层固体平板双层培养法固体平板双层培养法优点优点:固体培养基中的营养物质缓慢释放固体培养基中的营养物质缓慢释放下层可吸收培养物产生的有害物质下层可吸收培养物产生的有害物质B.琼脂糖珠培养琼脂糖珠培养优点优点 :改变了通气和营养环境改变了通气和营养环境 促进原生质分裂以及细胞团的形成促进原生质分裂以及细胞团的形成(4).饲养培养饲养培养(看护培养看护培养)A.滤膜饲养法滤膜饲养法B.琼脂糖珠的饲养培养琼脂糖珠的饲养培养(三三)植板密度植板密度1 Kao-KM8P优点优点:单个细胞能生壁单个细胞能生壁持续分裂持续分裂,形成愈伤组织形成愈伤组织2.饲养细胞层法饲养细胞层法3.两种不同物种原生质共培养两种不同物种原生质共培养此法适用于此法适用于两种原生质之间能发生有效的互馈两种原生质之间能发生有效的互馈两种原生质的愈伤组织形态上可区分两种原生质的愈伤组织形态上可区分(四四) 细胞分裂和愈伤组织形成细胞分裂和愈伤组织形成原生质体原生质体-细胞壁再生细胞壁再生-细胞团细胞团愈伤组织愈伤组织-植株植株1.壁的出现壁的出现:原生质体原生质体-球型改变球型改变-微纤丝微纤丝-细胞壁细胞壁培养培养24d2.细胞分裂细胞分裂:27d第一次分裂第一次分裂-细胞团细胞团-愈伤组织愈伤组织-转移转移(不含渗透压的培养基中不含渗透压的培养基中)23周周2周后周后(1) 细胞分裂不同步细胞分裂不同步(2).壁的形成与细胞分裂有直接关系壁的形成与细胞分裂有直接关系壁发育不全壁发育不全-核分裂核分裂,质不分裂质不分裂原因原因:清洗不彻底清洗不彻底,其它其它(3).应加外源生长素和细胞分裂素应加外源生长素和细胞分裂素与材料有关与材料有关加入后引起死亡加入后引起死亡加入时间不一加入时间不一3.培养条件培养条件(1) 光光:散射光或黑暗中培养散射光或黑暗中培养(47d)(2).温温 250300C以下以下(3).及时添加培养基及时添加培养基,及时转移固体培养基及时转移固体培养基(五五).植株再生植株再生1.需经历三种培养基需经历三种培养基:原生质培养基原生质培养基-愈伤愈伤分化培养基分化培养基-芽芽生根培养基生根培养基-根根胚胎发生途径胚胎发生途径原生质体原生质体-细胞团细胞团-去去2.4D培养上培养上-胚状体胚状体-植物植物