一种在豌豆植物中瞬时表达外源蛋白的新方法

一种在豌豆植物中瞬时表达外源蛋白的新方法关键词：豌豆；瞬时表达；发芽种子；真空侵染中图分类号：Q819文献标识码：A1材料和方法1.1实验材料1.1.1质粒、菌株、抗体及植物材料实验过程中所用抗生素利福平、卡那霉素、四环素及乙酰丁香酮均购自北京鼎国生物技术，DNA2000 Marker、蛋白质低分子质量Marker购自日本TakaRa公司，蛋白质杂交所用二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG，购自北京中山生物技术。用来鉴定豌豆早褐病毒载体pCAPE2-GFP的引物为：5-CGGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-TT-35-GGGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-C-3用来鉴定pCAPEl载体的引物为：5-CGTTAGATTGCGCTGTGG-35-TGCCTTTGCTACGAACCT-3以上引物由上海生物工程合成。分别以豌豆早褐病毒载体pCAPE2-GFP和pCAPEl为模板进展PCR鉴定，PCR反响条件为94预变性3min； 9450s，50 50s.7250s，33个循环；72 8min。反响完毕后进展琼脂糖凝胶电泳。本研究选择真空处理时间、菌体工作液浓度及真空压力3个因子对该体系进展优化，实验过程中以绿色荧光蛋白green fluorescent protein，GFP表达率表达绿色荧光蛋白的植株占总株数的比率来评价该体系的工作效率，实验设置3次重复，每次处理种子数目不少于20粒，结果取平均值。在真空压力0.08MPa和菌体工作液浓度OD00=1.01.5恒定的条件下选择真空处理时间分别为：1、10、15min对豌豆种子进展真空侵染，侵染后播种于土壤中，幼苗出土后紫外灯下跟踪绿色荧光蛋白的表达情况并记录。选择一样的菌体工作液浓度，分别采用叶片注射法及发芽种子真空侵染法进展接种，紫外灯下跟踪观察GFP的表达情况并拍照记录。在外源蛋白表达顶峰期分别搜集可溶性总蛋白，15%聚丙烯酰胺凝胶进展电泳后转膜，并以Rubisco大亚基作为内参，以GFP抗体检测外源蛋白质的表达情况。2.2实验结果2.2.1豌豆早褐病毒载体的PCR鉴定结果豌豆早褐病毒的两个载体同时接种植物才能完成正常的侵染工作，通过PCR法对pCAPE2-GFP载体上的GFP基因片段和pCAPEI上的特异片段进展鉴定，实验结果呈阳性，结果如图1所示。2.2.2发芽种子真空侵染体系的优化2.2.3发芽种子真空侵染法与叶片注射法的比较1215d时提取豌豆植物可溶性总蛋白，以Rubisco大亚基作为内参通过蛋白杂交法比较两种接种方法外源蛋白的表达量，实验结果如图4所示，Rubisco大亚基杂交结果说明各泳道57植物蛋白质上样量根本一致，GFP杂交结果说明两种接种方法外源蛋白的表达量相当。3讨论参考文献References：2RAMWSSAR K，SABALZA M，CAPELL T，et al.Maize plants：An ideal production platform for effective and safe molecularpharmingJ. Plant Science， 2021， 1744：409-419.6LIU J Y，MA P D，SUN Y，et al.Expression of human acidicfibroblast growth factor in Nicotiana benthamiana with a pote-to-virus-X-based binary vectorJ. Biotechnology and AppliedBiochemistry， 2007， 483：143-147.8GREEN B J，FUJIKI M，METT V，et al.Transient protein ex-pression in three Pisum sativum green pea varietiesJ.Biotech-nology Joumal， 2021，42：230-237.9JIA H，PANG Y，FANG R.Agroinoculation as a simple way todeliver a tobacco mosaic virus-based expression vectorJ.Ac-to Botanica Sinica， 2003， 457：770-773.本文档【一种在豌豆植物中瞬时表达外源蛋白的新方法】更多文档欢迎访问wendang.chazidian