《发酵工艺》第一章-菌种选育课件

第一章第一章 菌种选育菌种选育 第一节第一节 工业常用微生物及要求工业常用微生物及要求一、常见微生物一、常见微生物 （一）细菌（一）细菌（bacteriabacteria）醋杆菌属（醋杆菌属（AcetobacterAcetobacter）乳杆菌属（乳杆菌属（LactobacillusLactobacillus）芽孢杆菌属（芽孢杆菌属（BacillusBacillus）短杆菌属（短杆菌属（BrevibacteriumBrevibacterium）棒杆菌属（棒杆菌属（CorynebacteriumCorynebacterium）（二）放线菌（二）放线菌（actinomycesactinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibioticantibiotic）链霉菌（链霉菌（StreptomycesStreptomyces）小单孢菌属（小单孢菌属（MicromonosporaMicromonospora）（三）霉菌（三）霉菌（mouldmould）1.1.曲霉属（曲霉属（AspergillusAspergillus）黑曲霉（黑曲霉（A.nigerA.niger）米曲霉（米曲霉（A.oryzaeA.oryzae）黄曲霉（黄曲霉（A.flavusA.flavus）2.2.青霉属（青霉属（PenicillumPenicillum）桔青霉（桔青霉（P.citrinumP.citrinum）产生产生5 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。3.3.根霉属（根霉属（RhizopusRhizopus ）米根霉（米根霉（R.oryzaeR.oryzae）华根霉（华根霉（R.chinensisR.chinensis）4.4.红曲霉属（红曲霉属（MonascusMonascus）（四）酵母（四）酵母（yeastyeast）1.1.酵母属（酵母属（SaccharomycesSaccharomyces）啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2.2.假丝酵母属（假丝酵母属（CandidaCandida）产朊假丝酵母（产朊假丝酵母（Candida utilisCandida utilis）3.3.毕赤酵母属（毕赤酵母属（PichiaPichia）（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.担子菌（担子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇类）即菇类（mushroommushroom）2.2.藻类（藻类（algaalga）几几种种菌菌落落 （六）噬菌体（六）噬菌体（phagephage）危害以细菌和放线菌为生危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。产菌株的发酵工业。特点：特点：1.1.体积比细菌小得多，可以通体积比细菌小得多，可以通 过细菌滤器。过细菌滤器。2.2.没有细胞结构，由核酸和蛋没有细胞结构，由核酸和蛋 白质构成。白质构成。3.3.营专性活物寄生，即只能在营专性活物寄生，即只能在 特异性寄主细胞中增殖。特异性寄主细胞中增殖。烈性噬菌体烈性噬菌体 引起寄主细胞迅速裂解。引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体温和噬菌体 随寄主细胞的繁殖而繁殖。随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。吸附吸附吸附吸附注入核酸注入核酸注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质释放释放释放释放装配装配装配装配 二、微生物工业对菌种的要求二、微生物工业对菌种的要求1.1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.2.易控制培养条件，发酵周期较短。易控制培养条件，发酵周期较短。3.3.抗杂菌和噬菌体的能力强。抗杂菌和噬菌体的能力强。4.4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和不易变异和退化，不产生任何有害物质和 毒素。毒素。第二节第二节 工业微生物菌种的选育工业微生物菌种的选育一、自然选育一、自然选育（一）从自然界分离获得菌种（一）从自然界分离获得菌种采样采样增殖培养增殖培养（富集培养（富集培养 enrichmentenrichment）提供有利于所需菌株生长而不利于提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，即其它菌型生长的条件，即让目的微生物让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。在种群中占优势，使筛选变得可能。方法：方法：（1 1）控制培养基成分）控制培养基成分（2 2）控制培养条件）控制培养条件（3 3）抑制不需要的菌类）抑制不需要的菌类3.3.纯种分离纯种分离（1 1）划线法：简单、快捷。）划线法：简单、快捷。（2 2）稀释法：菌落单一均匀，适合分）稀释法：菌落单一均匀，适合分 离具有蔓延性的微生物。离具有蔓延性的微生物。固体培养基四区划法接种法固体培养基四区划法接种法接种针先以火焰灭菌法灭菌接种针先以火焰灭菌法灭菌 步骤一轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却 步骤二以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。步骤三更换一个新的无菌营养平板更换一个新的无菌营养平板 步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区上。此为第一菌区 。步骤五重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六由第五步骤的第一区中划出第二由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。区，如右上图。步骤七重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。第二区中划出第三区，如右上图。步骤八重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。的营养平板，如右上图。步骤九 在营养平板上贴好标在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及作者姓名、菌种学名以及培养基名称。培养基名称。步骤十步骤十固体培养基的稀释涂抹接种法固体培养基的稀释涂抹接种法需要使用的仪器需要使用的仪器震荡机震荡机 吸取准备好欲稀释的菌液吸取准备好欲稀释的菌液吸取充分均匀后的菌液吸取充分均匀后的菌液 取含有取含有 9mL9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。将将试试管管于于震震荡荡机机上上，使使菌菌液液混混合合均均匀匀 取出试管中的第一次十倍稀释菌液取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL1mL，加入另一个新的含加入另一个新的含9mL9mL无菌水的试管中。无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。从最后稀释菌液中吸取从最后稀释菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入准备好的无菌琼脂内。置入准备好的无菌琼脂内。将三角玻璃棒浸于酒精中将三角玻璃棒浸于酒精中 将三角玻璃棒在火焰上燃烧将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。数推算出菌液浓度。4.4.生产性能的测定生产性能的测定 一般采用两步法：一般采用两步法：初筛：以量为主初筛：以量为主 复筛：以质为主复筛：以质为主（二）从自发突变体中获得菌株（二）从自发突变体中获得菌株 自自然然状状态态下下，碱碱基基对对发发生生自自然然突突变变的的机机率为率为1010-8-81010-9-9，自然突变有两种情况，自然突变有两种情况：一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退退和和生生产产质质量量的的下下降降，这这种种突突变称为负突变。变称为负突变。另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产有利，这种突变称为正突变。产有利，这种突变称为正突变。二、诱变育种二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。因突变进行的筛选，称为诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。称为诱变剂。诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 诱变育种的主要环节诱变育种的主要环节（1 1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液 诱变诱变（2 2）用合适的方法淘汰负效应变异株，）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株选出性能优良的正变异株筛选筛选 （一）诱变育种的程序（一）诱变育种的程序选择出发菌株选择出发菌株 制备菌悬液制备菌悬液 前培养前培养 物理诱变物理诱变诱变诱变 变异菌株的分离和筛选变异菌株的分离和筛选 化学诱变化学诱变（二）突变株的筛选（二）突变株的筛选1.1.随机筛选：传统方法随机筛选：传统方法（1 1）摇瓶筛选法）摇瓶筛选法（2 2）琼脂块筛选法）琼脂块筛选法2.2.理化性筛选理化性筛选方法一：降低终产物浓度方法一：降低终产物浓度a.a.筛选终产物营养缺陷型筛选终产物营养缺陷型nAaBbCcDdEnb.b.筛选细胞膜透性改变的突变株筛选细胞膜透性改变的突变株 使终产物排出细胞，以降低细胞内终使终产物排出细胞，以降低细胞内终产物浓度。产物浓度。如：用谷氨酸棒杆菌（如：用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium Corynebacterium glutamicumglutamicum）的生物素营养缺陷型）的生物素营养缺陷型（biotin deficiencybiotin deficiency）进行谷氨酸发酵。）进行谷氨酸发酵。生物素：生物素：B B族维生素的一种，又称维族维生素的一种，又称维生素生素H H或辅酶或辅酶R R。是合成脂肪酸所必需的。是合成脂肪酸所必需的。脂肪酸的生物合成：脂肪酸的生物合成：利用乙酰利用乙酰CoACoA（直接原料是丙二酸单（直接原料是丙二酸单酰酰CoACoA）在乙酰）在乙酰CoACoA羧化酶（辅基为生物羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。素）催化下合成。脂肪酸甘油磷酸脂肪酸甘油磷酸 磷脂蛋白质磷脂蛋白质 生物膜生物膜 因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。使胞内代谢产物迅速排出的方法使胞内代谢产物迅速排出的方法 1.用生理学手段用生理学手段 直接抑制膜合成或使膜受缺损直接抑制膜合成或使膜受缺损 如如:Glu发酵中，控制生物素发酵中，控制生物素亚适量亚适量可大量分泌可大量分泌Glu；当培养液中生物素含量较高时采用当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉适量添加青霉素素的方法；的方法；2.利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，限制地添加油酸，合成有缺损的膜。合成有缺损的膜。应用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸过量的应用甘油缺陷型菌株，即便在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。情况下，也可以获得大量谷氨酸。控制细胞膜的渗透性控制细胞膜的渗透性1.1.通过生理学手段控制细胞膜渗透性通过生理学手段控制细胞膜渗透性2.2.通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性生物素生物素谷氨酸谷氨酸细胞膜渗透性细胞膜渗透性青霉素青霉素谷氨酸谷氨酸油酸缺陷型油酸缺陷型油酸油酸方法二：筛选抗反馈突变株方法二：筛选抗反馈突变株抗反馈控制突变株抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。抗反馈控制突变株可以从抗反馈控制突变株可以从终产物结构类终产物结构类似物抗性突变株似物抗性突变株中获得。中获得。营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选诱变诱变淘汰野生型菌株：淘汰野生型菌株：抗菌素法、菌丝过滤法抗菌素法、菌丝过滤法检出缺陷型：检出缺陷型：影印法影印法夹层法夹层法逐个检出法逐个检出法限量补充培养法限量补充培养法确定生长谱确定生长谱 第三节第三节 生产菌种的改良生产菌种的改良 一、原生质体融合（一、原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）1.1.标记菌株的筛选标记菌株的筛选 2.2.原生质体的制备原生质体的制备 3.3.原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脱水剂）脱水剂 助融剂助融剂 CaCa2+2+提高融合频率提高融合频率 4.4.融合子的选择融合子的选择二、二、DNADNA重组技术重组技术 （DNA recombination technologyDNA recombination technology）1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得2.2.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接3.3.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞4.4.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞 第四节第四节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退一、菌种的衰退 衰退原因衰退原因1.1.菌种保藏不当菌种保藏不当2.2.菌种生长条件没有得到满足菌种生长条件没有得到满足二、二、菌种的复壮菌种的复壮 1.1.纯种分离纯种分离 2.2.通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮 3.3.淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体三、菌种保藏三、菌种保藏 1.1.原理原理 低温、干燥、缺氧、缺营养物质低温、干燥、缺氧、缺营养物质 2.2.方法方法 （1 1）斜面保藏法）斜面保藏法 （2 2）干燥保藏法）干燥保藏法 （3 3）悬液保藏法）悬液保藏法 （4 4）冷冻干燥保藏法）冷冻干燥保藏法 （5 5）液氮保藏法）液氮保藏法 （6 6）低温保藏法）低温保藏法 第五节第五节 种子的扩大培养种子的扩大培养一、微生物的培养方法一、微生物的培养方法 1.1.表面培养表面培养 2.2.固体培养固体培养 3.3.液体深层培养液体深层培养二、菌种的扩大培养二、菌种的扩大培养 种子扩大培养的概念种子扩大培养的概念 指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。为种子。菌种扩大培养的目的：菌种扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料提供相当数量的为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。代谢旺盛的种子。q接种量的需要接种量的需要q菌种的驯化菌种的驯化q缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平 （一）种子制备的工艺流程（一）种子制备的工艺流程 摇瓶摇瓶保藏菌种保藏菌种 试管斜面活化试管斜面活化 茄瓶斜面茄瓶斜面 种子罐种子罐 固体培养基固体培养基生理代谢生理代谢菌种筛选菌种筛选种子培养种子培养发酵培养发酵培养（二）（二）斜面菌种的培养斜面菌种的培养 1.1.不宜多次移种。不宜多次移种。2.2.活化斜面中加活化斜面中加0.1%0.1%葡萄糖。葡萄糖。培养基特点：原料较精细。培养基特点：原料较精细。（三）一级种子培养（摇瓶）（三）一级种子培养（摇瓶）培养基特点培养基特点：使用的原料基本接近于发酵培养基。使用的原料基本接近于发酵培养基。（四）二级种子培养（种子罐）（四）二级种子培养（种子罐）培养基的特点培养基的特点：和一级种子相似，其中葡萄糖用和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，水解糖代替，更接近于发酵培养基。更接近于发酵培养基。（五）种子罐级数（五）种子罐级数制备种子需逐级扩大培养的次数。制备种子需逐级扩大培养的次数。谷氨酸：一级种子罐扩大培养（二级发酵）谷氨酸：一级种子罐扩大培养（二级发酵）摇瓶培养摇瓶培养一级种子（小罐）一级种子（小罐）发酵发酵青霉素：二级种子罐扩大培养（三级发酵）青霉素：二级种子罐扩大培养（三级发酵）摇瓶培养摇瓶培养一级种子（小罐）一级种子（小罐）二级种子（中罐）二级种子（中罐）发酵发酵发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据q级数受发酵规模、菌体生长特性、接种级数受发酵规模、菌体生长特性、接种 量的影响。量的影响。q级数大，难控制、易染菌、易变异，管级数大，难控制、易染菌、易变异，管 理困难，一般理困难，一般2-42-4级。级。（六）种龄与接种量（六）种龄与接种量 1.1.种龄种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对 较大。较大。2.2.接种量接种量 移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量 接种后培养液的体积接种后培养液的体积 一般：一般：细菌细菌 1 1 霉菌霉菌 7 7 1515双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。大量地接入培养成熟菌种的优点：大量地接入培养成熟菌种的优点：1.1.可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵 周期，提高了设备利用率。周期，提高了设备利用率。2.2.节约了发酵培养的动力消耗。节约了发酵培养的动力消耗。3.3.并有利于减少染菌机会。并有利于减少染菌机会。工业发酵的目的工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性改变微生物遗传特性(遗传学方法）；遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；改变细胞膜透性；