《发酵工艺》第二章-培养基及其制备课件

第二章第二章 培养基及制备培养基及制备 第一节第一节 工业发酵培养基工业发酵培养基 发酵培养基的作用：发酵培养基的作用：满足菌体的生长满足菌体的生长 促进产物的形成促进产物的形成一、工业上常用的碳源（一、工业上常用的碳源（carbon carbon sourcesource）1.1.谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉）谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉）应用最广。应用最广。使用条件：使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点：缺点：a.a.难利用、发酵液比较稠、一般难利用、发酵液比较稠、一般2.0%2.0%时加入时加入 一定的一定的-淀粉酶。淀粉酶。b.b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点：优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。2.2.葡萄糖葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。萄糖效应。工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一但是糖液必须达到一定的质量指标。定的质量指标。3.3.糖蜜糖蜜 （制糖工业上的废糖蜜或结晶母液（制糖工业上的废糖蜜或结晶母液）cane molassescane molasses包括包括 beet molasses beet molasses 糖蜜使用的注意点：糖蜜使用的注意点：除除糖份糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生外，含有较多的杂质，对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、影响结晶）、钙盐（影有害物质：胶体成分（起泡、影响结晶）、钙盐（影 响结晶）、响结晶）、生物素（代谢控制）。生物素（代谢控制）。预处理：澄清预处理：澄清脱钙脱钙脱除生物素脱除生物素例：柠檬酸发酵例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：黄血盐预处理：黄血盐二、工业上常用的氮源（二、工业上常用的氮源（nitrogen nitrogen sourcesource）1.1.无机氮：无机氮：种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素特点特点：吸收快，也称之迅速利用的氮源。但无机：吸收快，也称之迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起氮源的迅速利用常会引起pHpH的变化的变化,如：如：(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH 无机氮源被菌体利用后，培养液中留下了酸性或无机氮源被菌体利用后，培养液中留下了酸性或碱性物质。碱性物质。代谢后形成酸性物质的无机氮源称代谢后形成酸性物质的无机氮源称生理酸性物质生理酸性物质，如硫酸铵。如硫酸铵。代谢后产生碱性物质的无机氮源称代谢后产生碱性物质的无机氮源称生理碱性物质生理碱性物质，如硝酸钠。如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的程的pHpH有积极作用。有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义：q 满足菌体生长满足菌体生长q 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pHpH无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素毛霉产蛋白酶的研究毛霉产蛋白酶的研究2.2.有机氮：有机氮：来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。提供大量的无机盐及生长因子。三、无机盐三、无机盐（inorganic mineralinorganic mineral）硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。四、生长因子（四、生长因子（growth factorgrowth factor）微生物生长不可缺少的微量有机物质。如微生物生长不可缺少的微量有机物质。如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。1.1.生物素生物素2.2.作用：主要影响细胞膜通透性，同时也影作用：主要影响细胞膜通透性，同时也影响菌体的代谢途径。即：影响菌体生长和响菌体的代谢途径。即：影响菌体生长和谷氨酸积累。谷氨酸积累。3.3.过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。4.4.不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。5.5.因此，要达到菌体生长需要的因此，要达到菌体生长需要的“亚适亚适量量”。2.2.提供生长因子的农副产品原料提供生长因子的农副产品原料（1 1）玉米浆：（）玉米浆：（corn steep liquor,CSLcorn steep liquor,CSL）最具代表性。最具代表性。（2 2）麸皮水解液）麸皮水解液（3 3）糖蜜）糖蜜（4 4）酵母）酵母五、发酵培养基的设计和优化五、发酵培养基的设计和优化 设计步骤：设计步骤：初步确定可能的培养基成分；初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验确定适宜的培养基成分；通过单因子实验确定适宜的培养基成分；采用正交试验法确定各成分最适浓度。采用正交试验法确定各成分最适浓度。类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化郭秒,食品与工业发酵，2004类胡萝卜素的作用：色素、营养保健原原培养基培养基:初步确定可能的培养基成分初步确定可能的培养基成分(以碳源为例以碳源为例)通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 正交设计确定优化的配方正交设计确定优化的配方结果结果：碳源：碳源：乙酸钠乙酸钠 0 0.2%2%氮源：氯化铵氮源：氯化铵 0.2%0.2%酵母膏酵母膏 0.03%0.03%无机盐无机盐:复合无机盐复合无机盐0.05%0.05%摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础发酵罐：反应器水平,可以得出最 终优化的基 础配方pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究 第二节第二节 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备 在工业生产中，将淀粉水解为葡在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（萄糖（glucoseglucose）的过程称淀粉的糖化，的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。制得的溶液叫淀粉水解糖。一、淀粉水解制糖的意义一、淀粉水解制糖的意义1.1.大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）基酸生产菌不能直接利用）2.2.2.2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。缓慢，发酵周期延长。3.3.3.3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。二、淀粉水解糖的制备方法及原理二、淀粉水解糖的制备方法及原理（一）酸解法（一）酸解法（acid hydrolysis methodacid hydrolysis method）以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。生成葡萄糖的方法。1.1.水解过程：水解过程：总反应式：总反应式：(C C6 6H H1010O O5 5)n n+nH+nH2 2O nCO nC6 6H H1212O O6 6过程：过程：(C C6 6H H1010O O5 5)n n (C(C6 6H H1010O O5 5)x x C C1212H H2222O O11 11 C C6 6H H1212O O6 6 淀粉淀粉 糊精糊精 麦芽糖麦芽糖 葡萄糖葡萄糖 H H+对作用点无选择性，对作用点无选择性，-1,4-1,4-糖苷键和糖苷键和-1,6-1,6-糖苷糖苷键均被切断。键均被切断。2.2.葡萄糖的复合反应和分解反应葡萄糖的复合反应和分解反应 在水解过程中，由于受到酸和热的作用，在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖 复合二糖复合二糖 5 5羟甲基糠醛羟甲基糠醛 复合低聚糖复合低聚糖 有机酸、有色物质有机酸、有色物质损失葡萄糖量损失葡萄糖量 7 7 11复合反应复合反应分解反应分解反应 不利影响：不利影响：（1 1）降低了葡萄糖的收率。）降低了葡萄糖的收率。（2 2）给产物的提取和糖化液的精制带来困难。）给产物的提取和糖化液的精制带来困难。复合反应：复合反应：生成的多数复合糖不能被微生物利用，使生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。发酵结束时残糖高。分解反应：分解反应：生成的生成的55羟甲基糠醛是产生色素的根羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。源，增加了糖化液精制脱色的困难。如何控制分解反应和复合反应的发生？如何控制分解反应和复合反应的发生？（1 1）淀粉乳浓度）淀粉乳浓度（2 2）酸浓度）酸浓度 不能过高不能过高（3 3）温度）温度 3.3.评价评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。缺点：缺点：（1 1）副产物多，影响糖液纯度，一般）副产物多，影响糖液纯度，一般DEDE值只有值只有9090左右。左右。（2 2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度 较高的精制淀粉。较高的精制淀粉。DEDE值：值：dextrose equivalent valuedextrose equivalent value （葡萄糖当量值）葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（）还原糖含量（）DEDE值值 100 100 干物质含量（）干物质含量（）（二）酶解法（二）酶解法（enzyme hydrolysis enzyme hydrolysis methodmethod）用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。水解为葡萄糖的工艺。分两步：分两步：（1 1）液化：液化：用用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖，淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖，（2 2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精 和低聚糖转化为葡萄糖。和低聚糖转化为葡萄糖。所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法称双酶法(double enzyme hydrolysis method)double enzyme hydrolysis method)。1.1.液化（液化（liquificationliquification）2.2.淀粉酶水解底物内部的淀粉酶水解底物内部的 1,41,4糖糖苷键，不能水解苷键，不能水解 1,61,6糖苷键，一般采用耐糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。高温淀粉酶，使液化速度加快。85859090 。液化程度的控制（液化后需糖化的原因）液化程度的控制（液化后需糖化的原因）a.a.糖液的糖液的DEDE值低（值低（-淀粉酶不能水解淀粉酶不能水解-1,6-1,6糖苷键）糖苷键）b.b.液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，使糖化酶难以利用。使糖化酶难以利用。c.c.糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范围。糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范围。根据生产经验，根据生产经验，DEDE值在值在2020 3030之间为好，之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。2.2.糖化（糖化（saccharificationsaccharification）糖化酶从非还原性末端水解糖化酶从非还原性末端水解-1,4-1,4糖苷键糖苷键和和-1,6-1,6糖苷键。糖苷键。终点确定：终点确定：DEDE值达最高时，停止酶反应。值达最高时，停止酶反应。3.3.评价评价 优点优点：（1 1）反应条件温和，不需高温、高压设备。）反应条件温和，不需高温、高压设备。（2 2）副反应少，水解糖液纯度高。）副反应少，水解糖液纯度高。（3 3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓 度下水解。度下水解。（4 4）糖液颜色浅，质量高。）糖液颜色浅，质量高。缺点：缺点：（1 1）生产周期长，一般需要）生产周期长，一般需要4848小时。小时。（2 2）需要更多的设备，且操作严格。）需要更多的设备，且操作严格。（三）酸酶结合法（三）酸酶结合法 （acid-enzyme hydrolysis methodacid-enzyme hydrolysis method）集酸解法和酶解法的优点而采取的生产集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分：工艺。根据原料淀粉性质分：1.1.酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。2.2.适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用料，若用-淀粉酶液化，短时间液化，反应淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底往往不彻底。2.2.酶酸法：先用酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。淀粉酶液化，再用酸水解。适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。（四）不同糖化工艺的比较（四）不同糖化工艺的比较项目项目酸解法酸解法酸酶结合法酸酶结合法酶酶解法解法DEDE值值919195959898羟羟甲基糠醛（）甲基糠醛（）0.30.30.0080.0080.0030.003色度色度10100.30.30.20.2淀粉转化率淀粉转化率909095959898工艺条件工艺条件高温加压高温加压高温加压高温加压常温常温过程耗能过程耗能多多多多少少副副产物产物多多中中少少生产周期生产周期短短中中长长设备规模设备规模小小中中大大防腐要求防腐要求高高较高较高低低适合发酵工艺情况适合发酵工艺情况 差差中中有利有利 第三节第三节 糖蜜原料糖蜜原料一、糖蜜的分类及组成一、糖蜜的分类及组成 含糖量含糖量 含氮量含氮量1.1.分类：分类：cane molasses cane molasses 高高 低低 beet molasses beet molasses 低低 高高2.2.组成：粘稠、黑褐色、半流动状液体。组成各组成：粘稠、黑褐色、半流动状液体。组成各 不相同。不相同。二、糖蜜的预处理二、糖蜜的预处理1.1.澄清：加酸，加絮凝剂（石灰）澄清：加酸，加絮凝剂（石灰）2.2.脱钙：加脱钙：加NaNa2 2COCO3 33.3.降低生物素含量（谷氨酸发酵中）降低生物素含量（谷氨酸发酵中）4.4.（1 1）去除生物素：活性炭及树脂吸附）去除生物素：活性炭及树脂吸附5.5.（2 2）拮抗生物素：加表面活性剂（）拮抗生物素：加表面活性剂（TweenTween 60 60），），6.6.阻止油酸合成阻止油酸合成7.7.（3 3）加青霉素：使细胞壁不完整）加青霉素：使细胞壁不完整8.8.菌种方面：使用油酸或甘油缺陷型。菌种方面：使用油酸或甘油缺陷型。