氟尿嘧啶的半抗原修饰及免疫原的制备分析研究 高分子材料学专业

目录中文摘要1英文摘要2第一章 绪论41.1. 引言41.2. 5-氟尿嘧啶51.2.1. 5-氟尿嘧啶的理化性质51.2.2. 5-氟尿嘧啶的作用机制61.2.3. 5-氟尿嘧啶的衍生物111.3. 半抗原改造181.3.1. 抗体181.3.2. 抗原与半抗原181.3.3. 半抗原改造免疫原的制备191.4. 5-氟尿嘧啶的半抗原设计211.4.1. 5-氟尿嘧啶的羧酸化221.4.2. 5-氟尿嘧啶免疫原的制备241.4.3. 免疫原的鉴定26第二章 5-氟尿嘧啶-1-乙酸282.1. 实验材料282.1.1. 实验试剂282.1.2. 实验设备292.1.3. 实验仪器292.2. 实验部分302.2.1. 5-氟尿嘧啶-1-乙酸（5-FUAA）的制备302.2.2. 免疫原的制备312.3. 制备5-FUAA的结果与讨论332.3.1. 实验结果332.3.2. 条件筛选332.3.3. 红外表征352.3.4. 核磁表征362.4. 免疫原的MALDI-TOF-MS表征372.4.1. 原理372.4.2. 样品前处理372.4.3. 点样402.4.4. 测试412.4.5. 结果分析412.5. 本章小结43第三章 5-氟尿嘧啶-1-丙酸443.1. 实验材料443.1.1. 实验试剂443.1.2. 实验设备453.1.3. 实验仪器463.2. 实验部分463.2.1. 5-氟尿嘧啶-1-丙酸（5-FUPA）的制备463.2.2. 免疫原的制备473.3. 制备5-FUPA的结果与讨论483.3.1. 实验结果483.3.2. 条件筛选及后处理493.3.3. 核磁表征503.4. 免疫原的MALDI-TOF-MS表征523.5. 本章小结54第四章 总结与展望55参考文献56致谢62摘要5-氟尿嘧啶（5-FU，5-fluorouracil）是一类广谱、高效的抗癌药物。它的分子量为130.077 g/mol，是小分子化合物，属于半抗原（hapten）。本文研究的主要内容是5-氟尿嘧啶的半抗原改造，将无免疫原性的小分子化合物5-氟尿嘧啶与具备免疫原性的蛋白质载体连结起来，成为带有T细胞抗原决定簇的大分子，使之获得免疫原性，从而方便此后制备5-氟尿嘧啶的单克隆抗体（mAb），建立针对5-氟尿嘧啶的免疫分析方法，通过对其给药后血药浓度变化的监测调整给药方案以提高其对肿瘤的治疗效果。其中，制备具有较高免疫活性的5-氟尿嘧啶免疫原，是建立测定5-氟尿嘧啶的免疫分析方法中至关重要的一步。1957年，5-氟尿嘧啶首次通过人工合成，之后一直作为首选的抗肿瘤药物，被用到临床治疗之中。无论单独使用或是与其他药物联用，5-氟尿嘧啶对于结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌等多种发生率较高的癌症都有抑制作用。但是，由于其半衰期短、毒副作用大等多种因素，限制了5-氟尿嘧啶的应用。近几十年来，科研工作者一直致力于合成疗效更高、毒副作用更小且治疗成本更低的5-氟尿嘧啶衍生物，其中自然也包括许多5-氟尿嘧啶的羧酸类衍生物。5-氟尿嘧啶分子本身并无游离的羧基。在半抗原改造过程中，若载体为蛋白质类，此二者的结合主要是通过肽键达成的。若半抗原没有羧基、氨基或羟基等活性基团，首先需要采用适当的方法使之连上活性基团，然后才能与蛋白质载体结合。综合各方面因素，将羧基引入半抗原是最常见、最实用的方法。故若想制备5-氟尿嘧啶的免疫原，首先要制备其羧酸类衍生物，然后与蛋白质载体连接。本文合成了连接臂长度分别为2和3的两种5-氟尿嘧啶羧酸衍生物5-氟尿嘧啶-1-乙酸（5-FUAA）和5-氟尿嘧啶-1-丙酸（5-FUPA），并将该衍生物与载体蛋白质(BSA & OV)交联，制得5-氟尿嘧啶的免疫原(5-FUAA-BSA，5-FUAA-OV，5-FUPA-BSA，5-FUPA-OV)。关键词：5-氟尿嘧啶、半抗原、免疫原作者：胡昌佳指导教师：邓安平 教授Abstract5-Fluorouracil (5-FU) is a broad spectrum, highly effective anticancer drug. It has a molecular weight of 130.077 g/mol and is a small molecule compound that belongs to the hapten. The main content of this study is the hapten modification of 5-fluorouracil. The non-immunogenic small molecule compound 5-fluorouracil is linked to an immunogenic protein carrier and becomes a macromolecule with T cell epitopes, which means the 5-fluorouracil obtain immunogenicity. This is important for the preparation of 5-fluorouracil monoclonal antibody (mAb), and an immunoassay method for 5-fluorouracil can be established,which can monitoring the blood dosing concentration and adjust the dosing regimen to improve the therapeutic effect on the tumor. Among them, the preparation of a 5-fluorouracil immunogen with high immunogenic activity is a crucial step in the establishment of an immunoassay method for the monitoring of 5-fluorouracil.In 1957, 5-fluorouracil was artificially synthesized for the first time, and has since been used as the best choice of anti-tumor drug for clinical treatment. Whether used alone or in combination with other drugs, 5-fluorouracil has good inhibitory effects on many cancers, such as colorectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, and liver cancer. However, the use of 5-fluorouracil is limited due to various factors like short half-life, high cycotoxic and so on. In recent decades, researchers have been working on the synthesis of 5-fluorouracil derivatives with higher efficacy, less side effects, and lower treatment costs, certainly including many 5-fluorouracil carboxylic acid derivatives.The 5-fluorouracil does not have free carboxyl groups. In the hapten modification process, if the carrier is a protein, the combination of the two is mainly achieved through peptide bonds. If the hapten lacks reactive groups such as carboxyl, amino, or hydroxy groups, it is necessary to attach the active group using a suitable method before binding to the protein carrier. In all aspects, the introduction of carboxyl groups into haptens is the most common and practical method. Therefore, if an immunogen for 5-fluorouracil is to be prepared, it is first necessary to prepare a carboxylic acid derivative, and then link the derivative to a protein carrier.In this paper, two 5-fluorouracil carboxylic acid derivatives, 5-FUAA and 5-FUPA, were synthesized. The derivative was cross-linked with carrier protein (BSA & OV) to produce 5-fluorouracil immunogen(5-FUAA-BSA, 5-FUAA-OV, 5-FUPA-BSA, 5-FUPA-OV).Keywords: 5-fluorouracil hapten artificial antige第一章 绪论1.1. 引言起源于上皮组织的恶性肿瘤即称之为癌，它是一类较为普遍的、严重危害人类身体健康，甚至威胁生命安全的重大疾病。 据世界卫生组织公告可知，癌症是导致人类非自然死亡的最主要原因之一，约占据总死亡人数的17%。 据往年统计结果，2005年，全球约有7,600,000人死于癌症；2012年，全球约有8,200,000人因罹患癌症而亡，而2017年，世界卫生组织统计，约有8,800,000人因恶性肿瘤治疗效果甚微而亡。 全球癌症死亡人数逐年递增，据最新统计，每年约新增超过14,000,000癌症患者，预计到2020年，全世界每一年，约有15,000,000新增癌症病例，到2030年这一数字将激增至21,000,000甚至更高。 如果不进一步采取行动，开发更加高效的抗癌药物，未来全球因癌症而死亡的人数将更加可怖。5-氟尿嘧啶是一类发展较为成熟，且抗癌活性较高的药物，它于1956年获得专利，并于1962年进入临床治疗，经过半个世纪的发展，目前5-氟尿嘧啶已经成为医疗卫生体系内最有效和最安全的药物之一，据统计，全世界每年有超过200万患者接受5-氟尿嘧啶的药物治疗，这使其成为治疗癌症最广泛使用的药物1。 5-氟尿嘧啶对消化系癌疗效较好，对宫颈癌等也有治疗效果2，是临床上治疗实体肿瘤的首选药物。但是，5-氟尿嘧啶的临床应用也有一定的局限性，例如，5-氟尿嘧啶的半衰期较短（t1/220 min），生物利用度低；它的口服吸收不规则，脂溶性低，在组织细胞内的浸透性差，难以制成口服制剂，目前临床上主要通过静脉注射给药，吸收后通过体液输送到全身（在血流丰富的组织中分布较多）3，这种给药方式对于患者身体负担较大，并不适用于连续化疗。并且5-氟尿嘧啶的有效治疗剂量与其毒性剂量十分接近，以致出现胃肠道、神经等各方面都较为严重的毒副作用。因此研究者们一直通过各种方式设计实验，以求合成高效低毒、性质稳定、给药方便的5-氟尿嘧啶前体药物。目前，已经有许多符合要求的药物被成功合成，并用于临床试验。同时，在临床研究中，许多事例表明，5-氟尿嘧啶的药物效果及毒副作用等各方面，存在着个体差异性较大的问题45，这意味着研究者要根据患者自身基本情况，制定个性化的给药方式6、剂量等，控制患者体内血药浓度，使患者得到最佳治疗，并且毒副作用尽量小。各种抗癌药物最佳给药方式7是人体的肿瘤部位和淋巴组织药物浓高而其他正常部位及血液中药物浓度尽量低的方式。通过文献所知，血浆中5-FU的浓度与患者的治疗效果之间存在着显著的相关性8，基于血浆中5-FU浓度的水平可以预估治疗结果以调整给药剂量，同时最大限度地减少5-FU治疗的副作用。因此，在对患者进行治疗的过程中，对于血药浓度的准确、快捷的监测至关重要，目前已用到的监测方法有微生物法、薄层层析法（TLC）、气相色谱法（GC）9、气质联用法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）10、液质联用法（LC-MS，LC-MS/MS）及My5-FU免疫分析方法11等。鉴于5-FU药物监测的重要性，本文旨在制备5-FU的免疫原，以便于后期制备5-FU的单克隆抗体，用于建立简单、快速、方便、便宜、高效的5-FU免疫分析方法，对5-FU的血药浓度进行监测，以提高5-FU的抗肿瘤效果，打破“癌症不可治愈”的谬论，为广大癌症患者带来福音。1.2. 5-氟尿嘧啶 1.2.1. 5-氟尿嘧啶的理化性质名称：中文5-氟尿嘧啶；别称氟尿嘧啶、氟脲嘧啶；英文5-fluorouracil；简写5-FU。分子式：C4H3FN2O2。结构式: 分子量：130.077g·mol -1。性状表现：白色（或偏浅黄色、接近白色）晶体/粉末，味苦，无臭12。溶解性：5-FU在水和乙醇中溶解度都较小，不溶于氯仿13。1g 5-氟尿嘧啶可以溶解在80mL水、170mL乙醇或55mL甲醇中。5-氟尿嘧啶具有两个可电离的质子，pKa 1 = 7.3，pKa 2 = 11.3（80） 14。在所存在环境的pH值较高时，5-氟尿嘧啶会形成其单盐或二盐，又因离子化而带上负电荷，主要以（图1.1）所示两种阴离子形式存在。由于盐的形成，其在水中的溶解度随着pH的增加而增加。图1.1. 5-FU离子化结构图亲核取代：由离子化的5-氟尿嘧啶可以看出，它的亲核取代在N1和N3位都可能发生，N1位的离子化结构较稳定15，N3位的电子云密度更大16，但是，N3处于两个羰基之间，受其空间位阻影响较大，使得N3位的亲核取代比N1位更加困难，因此亲核取代多发生在N1位，但是在许多情况下也会发生N1位和N3位的双取代，在特殊条件控制（如用基团保护N1位）下也能使亲核取代只发生在N3位。 分解：5-氟尿嘧啶在282-286熔化，分解产生剧毒氟化物和氮氧化物蒸气。5-氟尿嘧啶是光敏的、易燃的物质，并且与强氧化剂和碱不相容。它可以通过两条途径分解热分解和光化学分解。分解使得嘧啶环中N3和C4之间以及N1和C6之间的键断开，产生尿素。碱性水解产生巴比妥酸和尿嘧啶，巴比妥酸和尿嘧啶进一步降解为尿素17。1.2.2. 5-氟尿嘧啶的作用机制1.2.2.1. 5-氟尿嘧啶的代谢途径在渗透进入细胞后，5-FU通过两条相互竞争的途径进行代谢18：产生活性代谢产物的合成代谢途径，和使5-FU失活并导致药物从生物体内消除的分解代谢途径19。1.2.2.1.1. 合成代谢途径5-FU的合成代谢过程相当复杂（图1.2），具有不同的平行反应，与正常尿嘧啶的反应通路相同。最初，5-FU可以通过以下三种方式反应：图1.2. 5-FU的细胞内合成代谢机理图第一种方式是通过两个步骤形成5-氟一磷酸脱氧尿苷（5-FdUMP），即尿嘧啶脱氧核苷酸。 第一步，在胸腺嘧啶核苷磷酸化酶（TP）的作用下，在5-FU上接上一个脱氧核糖，生成5-氟尿嘧啶脱氧核苷（5-氟脱氧尿苷，5-FdUrd）。 随后通过胸腺嘧啶核苷激酶磷酸化产生5-氟一磷酸脱氧尿苷（5-FdUMP），它是一种公认的胸腺嘧啶脱氧核苷合成酶（TS）的抑制剂。第二第三两种方式均形成5-氟尿苷-5'-一磷酸（5-FUMP，一磷酸氟尿苷/5-氟一磷酸尿苷）。 第二种途径是直接一步反应生成5-氟一磷酸尿苷。在乳清酸磷酸核糖基转移酶（OPRT）的作用下，将来自5'-磷酸核糖基-1-焦磷酸（PRPP）的5'-一磷酸核糖转移至5-FU的 N1位，得到5-FUMP。 第三种途径有两个步骤。第一步，在尿嘧啶核苷磷酸化酶作用下将核糖接到5-FU上，得到5-氟尿苷（5-FUrd），然后通过尿嘧啶核苷激酶将其磷酸化成5-FUMP。然后，5-FUMP 可以进行两次连续的磷酸化。在嘧啶单磷酸激酶的作用下，形成5-氟尿苷-5'-二磷酸（5-FUDP，二磷酸氟尿苷），再通过嘧啶二磷酸激酶的作用生成5-氟尿苷-5'-三磷酸（5-FUTP，三磷酸氟尿苷），5-FUTP可以代替5'-三磷酸尿苷（UTP）并入RNA。5-FUTP 可以在 UDP 葡萄糖（或 N-乙酰葡糖胺）焦磷酸化酶的作用下与糖结合，生成5-氟尿嘧啶-核苷酸糖（5-FUDP-糖）。在5-FUMP 首次磷酸化为5-FUDP 后，核糖核苷酸还原酶将5-FUDP 2'位的核糖脱羟基，得到5-氟-2'-脱氧尿苷-5'-二磷酸（5-FdUDP，二磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷）。5-FdUDP也可由5-FdUMP的磷酸化作用形成。然后5-FdUDP经由嘧啶单磷酸激酶去磷酸化成5-FdUMP或经由嘧啶二磷酸激酶磷酸化成5-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸（5-FdUTP，三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷）。5-FdUTP是DNA聚合酶的底物，因此可以掺入DNA中。1.2.2.1.2.分解代谢途径在5-氟尿嘧啶经过静脉注射给药之后，超过 80的药物按照（图 1.3） 所示的途径被降解。5-FU的分解代谢与尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T）的自然还原途径基本相同。这种降解的第一阶段发生得非常快。在存在还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的辅基情况下，通过二氢嘧啶脱氢酶（DPD）的生物催化作用，使5-FU被还原为5,6-二氢-5-氟尿嘧啶（FUH2）。这个第一阶段有效地提高了合成代谢5-FU的速度。然后将FUH2的嘧啶环在 3 位和 4 位之间切割，得到 5-氟-酰脲丙酸（FUPA）。通过同时释放来自N3的氨和来自前嘧啶环的C2的二氧化碳，会产生5-FU的主要代谢产物5-氟-丙氨酸（FBAL）。铵离子（NH4+）和二氧化碳（CO2）会在尿素循环中形成尿素。图1.3. 5-FU的细胞内分解代谢机理图1.2.2.2. 5-氟尿嘧啶的作用机制5-FU的作用机制20一般为两种：如上所述，5-FU的代谢途径之一会产生5-FUTP。氟因为与氢原子大小相差不大，取代了正常尿嘧啶5位上的氢原子，并且在转录过程中，这种含氟核苷酸模拟普通核苷酸，被 RNA 聚合酶识别。这使得5-FU掺入了所有类型的RNA中。据了解，完整的细胞毒性源于由于掺入5-FU而引起的RNA的大量改变的综合作用，而不是改变单一功能。第二种作用方式是通过形成5-FdUMP活化5-FU。实际上，这种氟核苷酸是TS 的抑制剂，它涉及到DNA的合成。TS是细胞毒性剂的明显靶标，因为胸腺嘧啶核苷是唯一对DNA有特异性的核苷酸前体。在作为甲基保护基的5,10-亚甲基四氢叶酸（MeTHF）存在下，TS和2'-脱氧尿苷-5'-单磷酸（dUMP）形成三元复合物，其能够将dUMP的C5上的甲基转移，形成胸苷-5'-单磷酸（dTMP）。然后由5-FU形成足够的 5-FdUMP，甲基转移不被吸收，因为 5-FdUMP C 5位上的氟原子结合得比氢更紧密。然后酶被捕获在缓慢进行可逆反应的三元复合物中。MeTHF（或其聚谷氨酸盐）的存在对于FdUMP与TS的紧密结合是必不可少的。图1.4. 5-FU的作用机理图5-FU的存在阻断了dTMP的形成，从而降低了胸腺嘧啶核苷-5'-三磷酸（dTTP）对于DNA复制和修复。由TS抑制引起的“遗传毒性应激”可激活程序性细胞死亡途径。整个七十年代，人们相信5-FU的抗癌作用是以上两种机制的结果。 后来有报道称还有其他两种机制可能是5-FU细胞毒副作用的部分原因：第一种是将5-FU 掺入 DNA中。尿嘧啶（U）不是DNA的正常成分（一般情况下，DNA含碱基A/T/C/G，U属于RNA碱基成分），多种酶可以保护DNA免于掺入这种嘧啶：将dUTP水解成 dUMP 的脱氧尿苷三磷酸焦磷酸化酶；可识别和切除 DNA 中U的尿嘧啶-DNA-糖基化酶。然而，5-FdUTP 不被第一种酶识别，因此不被去磷酸化并且可以被并入DNA中，第二种酶不能够识别5-FU，因此不会从DNA链中切除它。第二种机制是经过5-FU处理后细胞的细胞膜功能的改变。 这与降低糖蛋白合成有关，这被认为是由于5-FUDP-糖的形成及其掺入内膜所致。这些途径在人类肿瘤中占主导地位的程度尚不清楚，并且可能会因为肿瘤类型的不同、给药方式和剂量不同而遵循不同的机理。对于5-FU作用机制简图如（图1.4）所示。1.2.3. 5-氟尿嘧啶的衍生物5-FU虽然是目前临床上用于结直肠癌等实体肿瘤的抗代谢药物之一，但是由于其半衰期短、导向性差、毒副作用较大等一系列原因，其临床运用受到了极大限制。因此，为了克服这些问题，国内外的科研工作者们经过对5-FU衍生物的研究，已经开发出许多具有高效率和低毒性的5-FU前药。1.2.3.1. 前药前药，是指通过生物作用转变成为活性药剂而本身并无药理活性的药物或化合物。合成前药的目的是对抗肿瘤药剂进行化学修饰使其暂时失活。在生物体内，前体药物会经适宜途径分解释放出活性成分。在大多数情况下，前药制备会选择含合适化学基团的物质与活性成分共价结合。这种物质必须是无毒的、在体内无生物活性且不稳定。并且这种物质通常会影响前药的溶解度、稳定性、释放活性成分的速率，以及其转化所需的特定酶。1.2.3.2. 临床试用的5-氟尿嘧啶前药1.2.3.2.1. 替加氟（Tegafur）图1.5. 替加氟结构式替加氟，别名呋氟尿嘧啶，分子式C8H9FN2O3，白色结晶粉末，1967年由前苏联Giller博士合成21，是5-FU第一例前药，其结构式如（图1.5）所示。经试验显示，替加氟的毒性只有5-FU的四分之一至七分之一；化疗指数增加一倍，并且没有严重的骨髓抑制。给药后2h对DNA、RNA及其相关物质合成的抑制作用达到峰值，且持续时间较长（12-20h）。同时，替加氟在血浆中的半衰期为5h，比之5-FU大大延长，使药物作用更为持久。1.2.3.2.2. 卡莫氟（Carmofur）图1.6. 卡莫氟结构式卡莫氟，别称氟脲己胺，分子式为C11H16FN3O3，白色结晶粉末，1975年由日本尾崎庄太郎合成，其结构式如（图1.6）所示。由于卡莫氟可在肝外代谢，故肝功能损害者亦可应用，其抗瘤谱与5-FU相同，但对大肠癌疗效较好，优于5-FU和替加氟。1.2.3.2.3. 卡培他滨（Capecitabine）卡培他滨，别名希罗达，分子式C15H22FN3O6，1998年在美国首次进入临床运用活化，其结构式如（图1.7）所示。卡培他滨在口服后被机体迅速吸收，然后在肝脏内被羧基酯酶转化为无活性的中间体5-氟-5'-脱氧胞苷（5-dFCR），然后经肝脏和肿瘤中胞苷脱氨酶的生物催化作用，转化为5-氟-5'-脱氧尿苷（5-dFUR）。卡培他滨与其代谢产物5-dFCR、5-dFUR都不具有细胞毒性，只有最后在肿瘤部位中经TP催化为5-FU才起作用22。这种经过三种酶的级联代谢（图1.8），使得卡培他滨在肿瘤中选择性地转化为5-FU，对肿瘤具有高选择性和特异性。药物试验结果显示：卡培他滨在给药后，肿瘤部位的5-FU浓度明显高于其他部位，体现了它的选择作用。同时，卡培他滨对于肿瘤的抑制效果显著高于5-FU，并且可以和多种抗肿瘤药物联用，使疗效更高。图1.7. 卡培他滨结构式图1.8. 卡培他滨代谢示意简图胞甘脱氨酶肝脏，肿瘤羧基酯酶肝脏，肿瘤肝脏TP1.2.3.2.4. 脱氧氟脲苷图1.9. 脱氧氟脲苷结构式脱氧氟脲苷，又称氟铁龙，分子式为C9H11FN2O5，1979年由美国Cook等人合成23，其结构式如（图1.9）所示,它是由一个5-FU分子在1位上结合一个伪戊糖而成。因此该化合物不能被磷酸化，也不能不经代谢直接转化成5-FU而掺入核酸内。所以，脱氧氟脲苷需要经过胸腺嘧啶核苷磷酸化酶（TP）切割5-FU，从而发挥抗肿瘤作用。而TP24是一种在多种实体肿瘤中广泛表达的酶，故脱氧氟脲苷在肿瘤部位的转化速率更快，从而起到了对肿瘤的选择作用。1.2.3.3. 5-氟尿嘧啶的其他衍生物目前临床上使用的许多5-FU前药已经克服了5-FU的一些缺点，例如，延长了5-FU在存留时间，使得药物作用更持久；提高了药物对于肿瘤细胞的选择性，降低了对正常细胞的毒害作用；制成更为方便的口服药剂等。然而，这些前药或多或少仍存在部分问题，需要更加细致、深入的研究加以改进，如，替加氟经过体内代谢转化为活性药物5-FU的血药浓度偏低；卡莫氟、脱氧氟脲苷等临床上还存在胃肠道、肝肾损害，神经毒性等副作用；各类药物的吸收不规则，且药物作用个体差异大；对肿瘤细胞的选择性不够高，对正常细胞仍有损害等不良反应。为了解决以上所提及的问题，人们在对5-FU的修饰工作上不断完善、改进，在其分子中引入了各类物质，如糖苷、氨基酸、短肽等小分子，以及聚酯、聚磷酸酯、聚酰胺、壳聚糖等大分子，以探究更加高选择性、高效、低毒、便利的5-FU新型前药。1.2.3.3.1. 糖苷修饰的5-氟尿嘧啶衍生物糖苷，是由单糖分子内的半缩醛羟基与另一个含羟基等基团的分子，通过脱水缩合作用而形成的一类含糖衍生物。它广泛存在于生物体中，并且由于具备不同结构而具有一些特殊的生物活性，从而担负着重要的生物功能，是生物体内不可缺少的一类物质。图1.10. 5-FU糖苷类衍生物结构示意图孙昌俊等人在1994年合成了12种5-FU的糖苷类化合物25，又在1997年合成了11个5-FU的糖苷类化合物26，其中一些化合物具有明显的抗癌活性。1999年，Rachel等人发表了关于糖苷修饰的5-FU前药制备及其药物活性研究的文章27，表明其合成的5-FU糖苷类化合物（图1.10）可以作为抗病毒药物使用，并且测试表明该化合物经过生物体内的酶水解后能在较短时间内快速释放出活性药物5-FU而发挥作用。2004年於海情等人也以糖为原料，合成了8种5-FU糖苷类衍生物28。2017年，郑丹等人合成5-氟尿嘧啶-D-氨基葡萄糖衍生物29，并且证明该衍生物体外稳定性良好，体内分布具有明显的肾靶向性。1.2.3.3.2. 氨基酸修饰的5-氟尿嘧啶衍生物对于氨基酸的需求量，正常细胞与肿瘤部位细胞具有显著差别，为了提高对肿瘤细胞的选择性，以氨基酸作为氮介载体的5 -FU前药已经具有许多研究成果。卓仁禧等人在1986-1991年期间通过多种方法相继合成了三十多种新的含5- FU的氨基酸衍生物303132，并且经过动物实验表明其中一部分衍生物具有比较高的抑瘤活性，同时毒副作用也较低。2005年，石德清等人成功合成了5-FU的氨基酸席夫碱盐33，如（图1.11）所示，并通过试验证明其对肺癌细胞具有较好的的抑制作用。图1.11. 5-FU氨基酸席夫碱衍生物结构示意图1.2.3.3.3. 短肽类修饰的5-氟尿嘧啶衍生物肽类化合物对细胞具有非常高的亲和性，因此，若使抗癌药物与肽链连接，用肽链辅助药物在机体内发挥作用，将会使其药物作用大大提高，优化治疗效果。1991年，卓仁禧等人利用修饰上甲酰基的5-FU与短肽反应，制备了5-氟尿嘧啶的N1-甲酰基二肽和三肽衍生物，并利用小鼠对合成的化合物进行抗癌活性测试，其结果显示所合成的化合物有较高的抑瘤率32。1994年，Nichifor等人以氨基酸为载体，制得了5-FU的二肽、四肽及五肽衍生物34。同年，罗毅等人也合成了两种短肽5-FU酯35。-氨基膦酸/磷肽因为与氨基酸/肽的结构相似性，具有很极强的生物活性和很高的药学价值，其中某些-氨基膦酸/磷肽已被用作抗癌、抗病毒药物。图1.12. 5-FU-1-基-磷三肽结构示意图刘学军等人分别在2001年、2002年通过实验制得了5-FU-1-磷二肽36和5-FU-1-磷三肽37，其结构如（图1.12）所示，生测结果也显示了这些化合物对于肿瘤生长具有一定的抑制性。1.2.3.3.4. 高分子修饰的5-氟尿嘧啶衍生物与高分子连接的抗癌药物可以利用高分子的特性，更为精准地控制给药剂量，或控制药物在体内的选择性释放。因此，高分子修饰的药物可以提高药物的有效利用率,降低其毒副作用，更好地治疗癌症。各类主链中含有5-FU的高分子化合物，最早是由卓仁禧等人合成，在此主要介绍由卓仁禧等人前期合成的5-FU高分子化合物。1981年，通过使5-氟尿嘧啶的钾盐与氯乙酸-氯烷基酯反应制备主链中含有5-氟尿嘧啶的四种新聚酯38。1984年，以二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，将5-氟脲嘧啶与无水碳酸钾（K2CO3）作用（碳酸钾在水中为弱碱，但在非质子极性溶剂中碱性增强），再与双氯乙酸二醇酯（ClCH2COOCH2CH2OOCCH2Cl）共缩聚，得到了6种5-氟尿嘧啶的聚酯类衍生物39。之后，又用5-FU分别与Cl-R-OH、HCHO反应,合成了4种1,3-二羟烷基-5-氟尿嘧啶40。1985年，合成了主链含5-FU聚磷酸酯的化合物41。同年，合成了3个极易溶于水且抗癌活性较好的5-FU的聚磷酸酯42。随之又合成了4种新的主链含5-FU聚酯型高分子化合物43。1987年，经过缩聚反应，制备了6种新型的侧链含5-氟尿嘧啶的聚酰胺衍生物44。1994年，又利用共聚反应45，合成了12种侧链含-FU的聚磷酰胺衍生物。以上所涉及较早时期的一系列聚脂肪烃、聚酯 、聚磷酸酯等含5-FU的高分子化合物，经动物试验后显示，药物毒性大为降低，半衰期大为延长 ，抗肿瘤活性略有差异46： 部分高分子结合物的抗肿瘤活性降低 ，猜测其原因是 5-FU从高分子中释放出来的速率不足以达到具有有效治疗效果的血药浓度；还有部分高分子结合物，如聚酯、聚磷酸酯等，则具有较为可观的抗肿瘤活性。1.2.3.3.5. 卟啉类修饰的5-氟尿嘧啶衍生物由于卟啉类化合物对恶性肿瘤有比较特殊的亲合性，因此它能够有选择地留在癌细胞中，即卟啉对于肿瘤具有导向性，并且，如果用特定波长的光照射卟啉化合物，不仅能够激发其产生特征荧光用于确定肿瘤轮廓，还能在有氧存在的情况下使其受激形成单线态氧而杀死细胞50。因此，卟啉的这种肿瘤导向性可以使药物选择性地杀死肿瘤细胞，从而在治疗癌症的同时避免对正常细胞的损害。将卟啉与药物5-氟尿嘧啶连接，合成卟啉-5-氟尿嘧啶化合物，以制得新的卟啉修饰的导向性前药，因其可观的研究前景，关于这方面研究已经受到了各方学者的广大关注。1985年，黄素秋等人将5-FU与四对磺酸苯基卟啉结合47，随之又以四苯基卟啉为载体，将4分子5- FU通过肽键与之键合，合成了另一种新型的5-FU卟啉衍生物48，并且其抗肿瘤活性试验结果证明它有更强的、更直接的抑瘤作用。2005年，刘彦钦通过单吡啶基三取代苯基卟啉与溴丙基化的5-FU在二甲基甲酰胺中回流反应，合成了吡啶基卟啉-5-氟尿嘧啶化合物49、吡啶基卟啉季铵溴化物。2012年，王晓梅等人又通过DCC联结卟啉和5-FU，合成了2种新型的卟啉-5-氟尿嘧啶衍生物50。1.2.3.4. 5-氟尿嘧啶衍生物总结通过以上5-FU自上世纪60年代至今的一系列衍生物合成的介绍可知，5-FU的各类化学修饰发展至今已经取得了非常可观的成就，其前药运用也更加广泛，各种给药方式和与其他药物联用的研究已经日趋完善，相信经过科研工作者们的不懈努力探索，具备定位杀死肿瘤细胞的氟尿嘧啶药物终将面世，解决各类实体肿瘤的治疗问题。1.3. 半抗原改造1.3.1. 抗体图1.13. 抗体分子结构示意图抗原结合位点在经过外源异物抗原分子，刺激动物机体的免疫系统之后，由浆细胞产生的、能与抗原特异性结合的免疫球蛋白（Ig，immunoglobin）即为抗体（Ab，antibody）。其结构单体如（图1.13）所示，是由两条相同的轻链和两条相同的重链（分子量约为轻链的两倍）组成，每条链上氨基酸种类、排列顺序等变化较大的区域称为可变区，相对稳定的部分称为恒定区。轻链和重链的可变区（VL,VH）参与抗原的结合。1.3.2. 抗原与半抗原能够诱导动物机体的免疫系统发生免疫应答的物质都能被视作抗原（Ag，antigen）。实际上，能被淋巴细胞特异性识别与结合，活化淋巴细胞，使之产生抗体的物质，即为抗原。一个完整的抗原应该同时具备有免疫原性和反应原性（也叫做免疫反应性）。免疫原性是指抗原能够诱导动物机体的免疫系统产生反应，而生成抗体的特性；反应原性，是指抗原能与自身诱导机体而产生的抗体发生特异性结合的特性。由上述可知，抗原也具有特异性，即一种抗原只能诱导一种特异的免疫应答，形成一种特异性抗体，且抗原只能与之诱导产生的特异性抗体发生特异性反应。然而，大多数小分子因缺乏T细胞决定簇而不能活化T细胞，使得B细胞无法被进一步活化而产生抗体，即无免疫原性。这种只具备反应原性而不具备免疫原性的小分子化合物，被称为半抗原（hapten）。半抗原必须经过改造，使之与具备T细胞决定簇的物质进行结合，从而获得免疫原性。1.3.3. 半抗原改造免疫原的制备兰德斯坦纳（Landstainer），一位杰出的医学家、生理学家，在20世纪初，将无免疫原性的小分子化合物与具有免疫原性的蛋白质进行结合，并将该结合物免疫动物后获得了能和该小分子化合物特异性结合的抗体，即通过与蛋白质结合后，小分子化合物获得了免疫原性。他将这种无免疫原性的小分子化合物称为半抗原（hapten），而将与之结合的具有免疫原性的蛋白质称为载体（carrier）51。此后，开展了大量有关半抗原组成、结构、性质和半抗原改造等方面的研究，为抗原性化学本质的阐述、抗原决定簇的研究以及抗原抗体相互作用机理的研究提供了大量的理论知识和实验支撑，为后继学者对于抗原的研究立下了基石。1.3.3.1. 半抗原修饰物活性基团的引入在半抗原改造过程中，若载体为蛋白质，其与半抗原的结合主要是通过脱水缩合形成肽键达成的。对于本身已带有氨基、羧基或者羟基等活性基团的半抗原，在一定环境下，它们可以与蛋白质载体直接连接；而对于没有活性基团的半抗原，首先需要采用适当的方法使半抗原连上活性基团，即制备半抗原的羧酸、氨基等衍生物，然后才能与蛋白质载体结合。相较之下，将羧基引入半抗原是最常见的方法。表1.1为几种常见的羧基引入方法。在进行不具备活性基团的半抗原修饰时，对于其修饰位点的选择也应当予以注意52。因为在半抗原的不同位点连上活性基团可能会使半抗原电子特性等方面发生不同程度的改变，进而使其与载体结合后形成的免疫原的免疫活性发生改变。并且，在对半抗原进行修饰时，应当选取距离半抗原特征基团或者特征原子较远的位点进行修饰，以保证半抗原特征结构的保留。而经过修饰后带上羧基或其他活性基团的半抗原修饰物必须具备一定的性质，才能使之后免疫动物使之产生抗半抗原抗体更加顺利。Goodrow等人53对此进行了较为详细的论述，认为半抗原修饰物应具备以下性质：Ø 半抗原修饰物在分子结构、构型、电子特性等方面应与半抗原类似，即尽量不改变半抗原的特殊结构，以便于动物机体对于半抗原的识别；Ø 半抗原修饰物应带有羧基等活性基团，以便与蛋白质载体结合；Ø 半抗原修饰物应具备合适长度的连接臂，以保证其既不受载体空间位阻的影响，又能避免半抗原性质的极大改变或者因连接臂太长而发生的折叠现象。1.3.3.2. 载体能与半抗原结合的具有免疫原性的载体不只有蛋白质，还有很多其他类别的载体，如多肽聚合物载体、其他大分子聚合物载体和颗粒载体等。表1.2较为详细地列出了各种类载体及其与半抗原的结合原理。其中最常用的载体是上表所示的BSA ，因为其理化性质稳定、免疫活性强、溶解度较大、价廉易得 ，且分子内有大量的氨基，使得BSA与半抗原/半抗原修饰物连接效率较高，以便获得具有较好免疫活性的免疫原。1.3.3.3. 半抗原与载体的连接带有羧基等活性基团的半抗原（小分子）可以通过多种方式与蛋白质载体结合，常用的几种方法如表1.3所示。将小分子与蛋白质通过上述方法连接，即制得具有免疫原性的免疫原。所得免疫原需进行纯化，除去未与蛋白质偶联的小分子或其他杂质。目前最为常用的纯化方法是透析，因为透析成本低，操作简便并且纯化效果较为理想，但是透析一般需要3-7天，比较耗时。最后将纯化好的免疫原冻干保存。1.4. 5-氟尿嘧啶的半抗原设计5-FU分子本身并无羧基或其他活性基团，不能直接与蛋白质载体偶联，对于没有活性基团的半抗原，首先需要使半抗原连上活性基团，然后才能与蛋白质载体结合。因此，要对5-FU进行结构上的设计修饰，以使其带上活性基团，便于与蛋白质载体偶联制备免疫原。对于无活性基团半抗原的修饰，-COOH是比较好的与蛋白质偶联的活性基团，故多在半抗原中引入羧酸，然后使其与蛋白质载体偶联，制备免疫原。1.4.1. 5-氟尿嘧啶的羧酸化通过1.2.1中5-FU的理化性质可知，其1、3位分别有一个可电离的质子，即在1、3位比较容易发生亲核取代反应，又由于3位的位阻效应，使得亲核反应多发生在5-FU的1位上。此外，5-FU与正常尿嘧啶以及胸腺嘧啶的差别是在5位C原子连接的基团，虽然也可在2、4位羰基位点上通过O-（羧甲基）羟胺法反应使之带上羧基，但是该反应不好控制其只与2位羰基反应而不影响4位羰基，4位羰基与5-FU的特殊原子F距离太近，若在该位点反应可能会影响5-FU的性质，故不考虑以O-（羧甲基）羟胺法在2、4位点引入活性基团。OCCOOH图1.14.a. 羟甲基化5-FU合成路径图结合以上所述，设计在5-FU的1位引入羧酸。又因为连接臂的长度对于抗原的免疫活性有一定影响，故设计合成具有不同长度连接臂的两个半抗原修饰物（羧酸化的5-FU）。通过1.2.3中5-FU衍生物以及其他相关文献的论述，总结在5-FU中引入羧酸的途径如图（1.14）所示。可先通过5-FU与甲醛反应得到羟甲基化的5-FU，再与CDI作用，然后与蛋白质偶联55；也可以将羟甲基化的5-FU与二酸进行酯化反应连上羧酸56，根据文献52，大多数连接臂的最佳长度在2-6，故可用乙二酸代替文献中的琥珀酸苷（图1.14.a）。或者，可以直接将5-FU羧乙基化，制得5-氟尿嘧啶-1-乙酸（5-FUAA）（图1.14.b）。用到的药品可以是氯乙酸与氢氧化钾5758、溴乙酸与氢氧化钾3659、或者氯乙酸乙酯与氢氧化钾60，再经盐酸水解。图1.14.b. 5-FUAA合成路径图此外，也可以合成5-氟尿嘧啶-1-丙酸（5-FUPA）（图1.14.c），这个可以通过丙烯酸乙酯、丙烯腈3061、氯代二酸二酯62等与5-FU反应制备，或直接与氯代单酯626364、溴代单酯65反应（图1.14.d）。a)CI(CH2)nCOOC2H5DMSOK2CO375 or a)Br(CH2)2COOC2H5DMFNaH55c)concHCl回流图1.14.d. 5-FUPA合成路径图图1.14.c. 5-FUPA合成路径图根据上述文献中的相关反应，并综合更方面条件，本文设计合成了5-氟尿嘧啶-1-5-FU5-FUAA5-FUPA图1.15. 5-FU的半抗原设计乙酸（5-FUAA）、5-氟尿嘧啶-1-丙酸（5-FUPA）两种连接臂长度分别为2和3的5-FU羧酸衍生物（半抗原修饰物）（图1.15）。首先合成5-FUAA。将氢氧化钾和5-FU混合反应成钾盐，再与氯乙酸反应，经浓盐酸酸化后制得5-FUAA。然后通过水重结晶对产品进行纯化。并用红外和核磁对产品进行结构表征。具体实验步及实验条件等将在第二章进行详细说明。再合成5-FUPA。将5-FU、K2CO3、KI、ClCH2CH2COOCH2CH3在75摄氏度下搅拌反应8小时，再将所得的酯水解得5-氟尿嘧啶-1-丙酸。所得酯和酸均留样干燥后，用1H-NMR进行表征以确证其结构。具体实验步及实验条件等将在第三章进行详细说明。1.4.2. 5-氟尿嘧啶免疫原的制备5-FU经过修饰后在其分子中引入了羧基，本文采用碳化二亚胺法，将半抗原修饰物与蛋白质载体进行连接。1.4.2.1. 蛋白质载体蛋白质载体选用BSA和OV两种。因为二者的分子量适中（分别为68000、43000左右），在与半抗原连接后易于进行MALDI-TOF-MS表征，且BSA和OV性质稳定、价廉易得，与小分子偶联也较好。1.4.2.2. 投料比由文献52可知，偶联比也会影响所得免疫原的免疫活性。免疫原中小分子与蛋白质载体的最佳偶联比约为10。但是，小分子与蛋白质载体的连接并非100%的反应，通过实验室以往经验，设计半抗原与蛋白质载体的投料比分别为为35:1，50:1。1.4.2.3. 碳化二亚胺法碳化二亚胺法中最关键的是碳化二亚胺，他是一类常用的失水剂，广泛用于促进羧基与氨基间脱水缩合形成肽键。目前最常用的碳化二亚胺为二环己基碳二亚胺（DCC）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）。电子重排+电子重排活性酯图1.16. 碳化二亚胺机理图一般情况下，有机相反应选用DCC/NHS，水相选用EDC/NHS。故需对5-FU的半抗原修饰物（5-FUAA和5-FUPA）在水和有机溶剂（DMF）中的溶解度进行试验。图1.17. 免疫原制备流程图通过5-FUAA的制备过程中应用水重结晶以纯化产品，可预计5-FUAA在水中的溶解度（室温）并不大。而5-FUPA应与5-FUAA溶解度相差无几。故预计采用DCC/NHS体系将半抗原与蛋白质偶联。其反应机理如（图1.16）所示，首先形成中间产物活性酯，然后再与蛋白质氨基反应，得到免疫原，制备流程图如（图1.17）所示。1.4.2.4. 免疫原最后将反应液用PBS透析七天，冻干保存。总共制得六种免疫原：5-FUAA-BSA（35:1）；5-FUAA-OV（35:1）；5-FUAA-BSA（50:1）；5-FUAA-OV（50:1）；5-FUPA-BSA（35:1）；5-FUPA-OV（35:1）。1.4.3. 免疫原的鉴定免疫原经纯化后还需要进行偶联率的测定。偶联率是指免疫原中半抗原/半抗原修饰物与载体的摩尔比。抗原的免疫活性不仅受半抗原本身结构、修饰位点等方面的影响，也受免疫原偶联率的影响，适当的偶联率可以提高免疫原的免疫活性，并有助于获得高亲和、高选择的特异性抗体。不同半抗原和载体所制得的免疫原所对应的最佳偶联率可能会有不同。免疫原的偶联率可以通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）进行测定，其原理是蛋白质与小分子结合后会所形成的免疫原以及原蛋白质可以经由MALDI-TOF-MS较为准确的测得其分子量，根据免疫原与原蛋白质分子量的差值，可以推出小分子与蛋白质的偶联比，计算公式如下：除此之外，免疫原的偶联率还可以通过紫外光谱法测定，也可以结合Bradford法54和紫外光谱法测定。第二章 5-氟尿嘧啶-1-乙酸2.1. 实验材料2.1.1. 实验试剂表2.1.实验试剂试剂名称化学式/结构式来源纯度5-氟尿嘧啶麦克林>99%氯乙酸阿达玛斯>99%氢氧化钾KOH国药-沪试AR浓盐酸HCl永华化学科技37%，AR超纯水H2O实验室自制二环己基二亚胺（DCC）沃凯>99%N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）Sigma-Aldrich>99%十二水合磷酸氢二钠国药-沪试AR二水合磷酸二氢钠国药-沪试AR氯化钠NaCl国药-沪试ARN，N-二甲基甲酰胺（DMF）国药-沪试AR牛血清白蛋白（BSA）北京欣经科生物鸡卵清蛋白（OV）BIOSHARP2.1.2. 实验设备2.1.3. 实验仪器50ml 三颈圆底烧瓶（磨口，19/23）；空心玻璃塞（磨口，14 & 19#）；球形冷凝管（磨口，19#）；磁子；胶头滴管；注射器（2ml）；套管式橡皮塞（翻口，19/22）；pH试纸（1.4 - 3.0；5.5 - 9.0；1 - 14）；移液枪（20 - 200l）；移液器（500 - 5000l）；无菌枪头（200l）；无菌枪头（5000l）；定量滤纸；具孔橡胶塞一套 ;布氏漏斗；真空水泵；烧瓶夹；十字夹；茄形瓶；封口膜；离心管（5ml）；离心管（10ml）；核磁管。2.2. 实验部分2.2.1. 5-氟尿嘧啶-1-乙酸（5-FUAA）的制备K水浴加热搅拌30minKOHClCH2COOH60搅拌反应5h/20hconc. HClOK图2.1. 5-FUAA合成路线图5-FUAA的合成路线如（图2.1）所示，首先，称取2.5806 g 氢氧化钾（KOH，46mmol）加入到50 ml 三颈圆底烧瓶中，再向其中加入8 ml 超纯水，搅拌使其充分溶解，得氢氧化钾水溶液。然后，在烧瓶中加入1.5609 g 5-氟尿嘧啶（5-FU，12 mmol），三颈烧瓶一口装上球形冷凝管，冷凝回流；一口用橡皮塞塞住，便于加料；另外一口用空心塞塞住。用集热式恒温加热磁力搅拌器加热，搅拌30分钟，使之反应生成5-