肠道标本的细菌学检查

粪 便 标 本 的 细 菌 学 检 验 目 的 与 要 求o 掌 握 粪 便 标 本 的 方 法o 掌 握 粪 便 标 本 的 细 菌 学 检 验 程 序 与 方 法 Backgroundo 正 常 人 的 肠 道 中 栖 居 大 量 的 不 同 种 类 的 微 生 物 ， 组 成人 类 健 康 极 为 重 要 的 体 内 微 生 态 环 境 参 与 营 养 、消 化 、 吸 收 及 清 洁 肠 道 ， 维 护 健 康 的 作 用 。o 腹 泻 因 病 原 菌 或 病 毒 在 在 肠 道 繁 殖 引 发 ， 引 起 腹 泻 细 菌 种 类 多 。o 本 实 验 主 要 介 绍 疑 为 沙 门 菌 或 志 贺 菌 属 感 染 者 或 带 菌 者 的 粪 便 标 本 （ 或 直 肠 拭 子 ） 中 致 病 菌 的 分 离 和 鉴 定 。 o 由 于 肠 道 中 存 在 大 肠 埃 希 菌 等 很 多 条 件 致 病 菌 ， 其 与肠 道 致 病 菌 的 主 要 区 别 之 一 是 ： 大 多 数 条 件 致 病 菌 可分 解 乳 糖 ， 而 绝 大 多 数 肠 道 致 病 菌 则 不 分 解 乳 糖 。o 分 离 肠 道 致 病 菌 多 用 含 乳 糖 的 弱 选 择 性 鉴 别 培 养 液（ 如 麦 康 凯 琼 脂 等 ） 以 及 对 大 肠 埃 希 菌 等 条 件 致 病 菌有 较 强 抑 制 作 用 、 而 又 有 利 于 肠 道 某 些 致 病 菌 （ 如 沙门 菌 及 志 贺 菌 属 ） 生 长 繁 殖 的 强 选 择 性 鉴 别 培 养 液 。 Background Background粪 便 标 本 常 见 的 病 原 菌 ： G 菌 ： 葡 萄 球 菌 属 、 白 色 假 丝 酵 母 菌 、 艰 难梭 菌 、 结 核 分 枝 杆 菌 、 蜡 样 芽 孢 杆 菌 G 菌 ： 志 贺 菌 、 沙 门 菌 、 致 病 性 大 肠 埃 希 菌 、霍 乱 弧 菌 、 亲 水 气 单 胞 菌 、 类 志 贺 邻 单 胞 菌 、弯 曲 菌 、 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 菌 试 剂 与 器 材o 菌 株 ： 伤 寒 沙 门 菌 o 培 养 基 ： 麦 康 凯 和 SS琼 脂 平 板 o 各 种 生 化 反 应 培 养 液 及 革 兰 氏 染 液 等 试 剂 （ 可参 见 微 生 物 的 自 动 分 析 及 附 录 ） o 沙 门 菌 多 价 “ O” （ A-F组 ） 及 单 价 “ O” 诊 断 血清 、 “ H” 因 子 诊 断 血 清 标 本 的 采 集o 由 于 粪 便 中 细 菌 种 类 很 多 ， 故 应 根 据 检 查 目 的 的不 同 选 择 适 宜 的 培 养 液 或 用 适 当 方 法 处 理 ， 尽 可能 地 抑 制 杂 菌 ， 以 利 于 病 原 菌 的 检 出 。o 不 能 认 为 粪 便 中 细 菌 含 量 多 ， 粪 便 标 本 的 采 集 就无 须 无 菌 操 作 。 粪 便 标 本 的 采 集 也 应 遵 循 无 菌 操作 的 原 则 。 若 便 器 或 标 本 容 器 不 洁 而 污 染 了 变 形杆 菌 ， 就 可 能 影 响 病 原 菌 的 分 离 检 出 ， 甚 至 把 污染 菌 误 报 ， 造 成 误 诊 。 标 本 的 采 集o 采 样 的 时 期 应 合 适 。 疑 似 痢 疾 患 者 应 在 发 病 初 期 、 用药 前 采 取 标 本 。 粪 便 标 本 采 集 时 应 挑 取 无 尿 液 污 染 的有 脓 血 、 黏 液 部 分 的 粪 便 23g（ 液 状 粪 便 可 挑 取 絮状 物 ） ， 盛 于 无 菌 容 器 内 送 检 。o 在 无 法 获 得 粪 便 时 ， 可 采 用 直 肠 拭 子 ， 即 用 灭 菌 棉 拭子 经 0.9%氯 化 钠 溶 液 或 增 菌 培 养 液 湿 润 后 ， 插 入 肛门 内 )45cm处 ， 轻 轻 转 动 一 圈 后 取 出 ， 插 入 无 菌 试管 （ Cary Blair系 统 运 送 管 ） 或 保 存 液 中 送 检 ；o 疑 似 伤 寒 患 者 应 在 发 病 23周 内 采 集 粪 便 标 本 。 标 本 的 采 集o 在 无 法 获 得 粪 便 时 ， 可 采 用 直 肠 拭 子 ， 即 用 灭 菌 棉 拭子 经 0.9%氯 化 钠 溶 液 或 增 菌 培 养 液 湿 润 后 ， 插 入 肛门 内 )45cm处 ， 轻 轻 转 动 一 圈 后 取 出 ， 插 入 无 菌 试管 （ Cary Blair， 卡 布 系 统 运 送 管 ） 或 保 存 液 中 送检 ； 应 采 集 可 疑 粪 便 ， 如 立 即 患 者 粘 液 脓 血 便 、 霍 乱患 者 的 米 泔 水 样 便 等 。 以 为 换 乱 患 者 ， 硬 质 碱 性 蛋 白胨 水 中 。o 除 婴 幼 儿 外 ， 不 推 荐 用 棉 拭 子 做 常 规 病 原 菌 培 养 。o 粪 便 标 本 如 不 能 立 即 送 检 ， 可 将 标 本 放 入 甘 油 盐 水 保存 液 中 ， 或 保 存 于 冰 箱 内 （ 勿 超 过 2小 时 ） 。 粪 便 标 本 的 细 菌 学 检 验 程 序粪 便 标 本 或 肛 拭 子 道 标 本涂 片 增 菌 培 养 直 接 分 离 报 告革 兰 染 色 ； 动 力学 观 察 与 制 动 试验 （ KIA、 MIU）初 步 报 告 需 氧 培 养GN增 菌 液 或亚 硒 酸 增 菌 液碱 性 蛋 白 胨TCBS平 板 或 其它 碱 性 平 板 分 离 SS平 板MAC平 板EMB平 板 副 溶 血 性弧 菌 选 择平 板菌 落 形 态生 化 反 应菌 落 形 态 、生 化 反 应 、抗 血 清 凝 集药 敏菌 落 形 态 、 生 化 反 应 、抗 血 清 凝 集 药 敏 步 骤 与 方 法o 革 兰 氏 染 色o 志 贺 菌 与 沙 门 菌 ： 急 性 腹 泻 患 者 的 粪 便 标 本 划 线 接 种 于 SS平 板和 MAC平 板 。o 慢 性 腹 泻 患 者 志 贺 菌 或 携 带 者 应 接 种 GN增 菌 液 ， 沙 门 菌 接 种 亚硒 酸 盐 增 菌 液 ， 再 转 种 SS平 板 与 MAC平 板 ， 观 察 小 的 、 透 明或 半 透 明 、 无 色 或 浅 黄 色 的 可 以 菌 落 生 长 ， 有 时 SS平 板 可 见 中心 黑 色 菌 落 （ H2S） 。o 挑 选 三 个 可 疑 菌 落 分 别 接 种 三 支 KIA、 MIU培 养 基 ， 观 察 结 果 。o 挑 取 菌 落 进 行 革 兰 氏 染 色 ， 观 察 细 菌 形 态 、 排 列 。o 采 用 伤 寒 沙 门 菌 诊 断 血 清 进 行 血 清 学 鉴 定 。 步 骤 与 方 法o 生 化 反 应 鉴 定 第 2日 观 察 平 板 上 有 无 可 疑 菌 落 ， 用 接 种 针 于 上 述 平 板中 挑 取 单 个 可 疑 菌 落 （ 无 色 、 半 透 明 、 光 滑 、 较 小 ） 23个 ， 分 别 接种 至 23管 双 糖 培 养 液 内 ， 置 37 培 养 1824h。 第 3日 观 察 细 菌 生长 情 况 ， 根 据 表 102初 步 鉴 定 细 菌 种 类 ， 然 后 取 双 糖 培 养 液 上 的 菌落 进 行 系 列 生 化 鉴 定 。 o 表 不 同 肠 道 细 菌 在 双 糖 培 养 液 培 养 结 果 （ 教 学 实 验 模 拟 标 本 的 结果 ） 序 号 上 层 （ 乳 糖 ） 下 层 （ 葡 萄 糖 ） 动 力 可 能 结果 o 1 + + 有 大 肠 埃 希 菌 o 2 + 有 伤 寒 沙 门 菌 o 3 + 无 痢 疾 志 贺 菌 步 骤 与 方 法o 血 清 学 最 终 鉴 定 根 据 双 糖 培 养 液 及 系 列 生 化 反 应 结 果判 断 ， 最 后 利 用 血 清 学 实 验 对 细 菌 进 行 最 后 的 确 定 。 o 如 果 初 步 鉴 定 结 果 为 沙 门 菌 属 ， 则 取 双 糖 培 养 液 斜 面上 菌 苔 与 沙 门 菌 多 价 “ O”（ A-F组 ） 诊 断 血 清 作 玻 片 凝集 实 验 ， 如 凝 集 即 为 沙 门 菌 属 ， 然 后 分 别 与 A-F组 的 单价 “ O”诊 断 血 清 作 玻 片 凝 集 实 验 定 组 ， 最 后 以 H因 子 诊断 血 清 作 玻 片 凝 集 实 验 以 定 型 （ 种 ） ， 必 要 时 可 用 因子 诊 断 血 清 定 型 。 o 如 果 根 据 双 糖 培 养 液 及 系 列 生 化 反 应 结 果 判 断 ， 初 步鉴 定 结 果 为 志 贺 菌 属 ， 则 取 菌 苔 与 志 贺 菌 属 多 价 诊 断血 清 作 玻 片 凝 集 实 验 以 定 组 ， 必 要 时 可 用 因 子 诊 断 血清 定 种 或 型 。 步 骤 与 方 法o 若 为 较 典 型 的 沙 门 菌 生 化 反 应 ， 但 与 A-F组 多 价“ O”诊 断 血 清 又 不 发 生 凝 集 反 应 ， 应 考 虑 可 能 为 有VI抗 原 的 沙 门 菌 ， 可 将 菌 制 成 悬 液 以 100 加 热30分 钟 以 除 去 VI抗 原 后 ， 再 做 血 清 学 鉴 定 。o 如 为 较 典 型 的 志 贺 菌 生 化 反 应 又 不 与 其 多 价 诊 断 血清 发 生 凝 集 ， 则 可 用 同 样 方 法 加 热 100 1小 时 以破 坏 其 K抗 原 ， 再 做 玻 片 凝 集 反 应 鉴 定 之 。o 在 细 菌 的 血 清 鉴 定 中 ， 最 常 使 用 的 方 法 是 凝 集 反 应 ，其 基 本 原 理 是 细 菌 为 颗 粒 性 抗 原 ， 当 与 相 应 的 抗 体混 合 时 ， 在 一 定 浓 度 的 电 解 质 条 件 下 ， 可 出 现 肉 眼可 见 的 凝 集 现 象 。 步 骤 与 方 法o 取 一 洁 净 载 玻 片 ， 用 记 号 笔 划 两 个 11.5cm的 圆 圈 。 o 取 1： 5或 1： 10诊 断 血 清 一 接 种 环 置 于 玻 片 左 侧 圈 内 ，在 右 侧 圈 内 放 一 接 种 环 0.9%氯 化 钠 作 为 对 照 。 如 天 气炎 热 ， 环 境 温 度 高 ， 则 应 适 当 多 取 血 清 及 0.9%氯 化 钠 ，以 防 试 剂 短 时 间 内 干 涸 ， 影 响 结 果 的 观 察 。 o 用 接 种 环 取 待 鉴 定 的 新 鲜 细 菌 少 许 ， 分 别 研 磨 乳 化 于 诊断 血 清 及 0.9%氯 化 钠 内 使 之 均 匀 混 合 。 旋 转 摇 动 玻 片数 次 ， 13分 钟 后 观 察 结 果 。 o 按 上 述 操 作 方 法 ， 依 次 分 别 做 A-E多 价 血 清 定 属 ， 特 异性 O因 子 血 清 定 群 ， H因 子 血 清 定 型 （ 或 种 ） 。 结 果o 阴 性 ： 对 照 侧 及 实 验 侧 均 匀 混 浊 不 出 现 凝 集 。 o 阳 性 ： 盐 水 对 照 侧 呈 现 均 匀 混 浊 ， 实 验 侧 明显 凝 集 。 o 自 凝 ： 对 照 侧 及 实 验 侧 均 出 现 凝 集 。 步 骤 与 方 法o 取 一 洁 净 载 玻 片 ， 用 记 号 笔 划 两 个 11.5cm的 圆 圈 。 o 取 1： 5或 1： 10诊 断 血 清 一 接 种 环 置 于 玻 片 左 侧 圈 内 ，在 右 侧 圈 内 放 一 接 种 环 0.9%氯 化 钠 作 为 对 照 。 如 天 气 炎热 ， 环 境 温 度 高 ， 则 应 适 当 多 取 血 清 及 0.9%氯 化 钠 ， 以防 试 剂 短 时 间 内 干 涸 ， 影 响 结 果 的 观 察 。 o 用 接 种 环 取 待 鉴 定 的 新 鲜 细 菌 少 许 ， 分 别 研 磨 乳 化 于 诊断 血 清 及 0.9%氯 化 钠 内 使 之 均 匀 混 合 。 旋 转 摇 动 玻 片 数次 ， 13分 钟 后 观 察 结 果 。 o 按 上 述 操 作 方 法 ， 依 次 分 别 做 A-E多 价 血 清 定 属 ， 特 异 性O因 子 血 清 定 群 ， H因 子 血 清 定 型 （ 或 种 ） 见 p119。 注 意 事 项o 在 细 菌 的 血 清 鉴 定 中 ， 最 常 使 用 的 方 法 是 凝 集 反 应 ， 其 基 本 原 理 是 细菌 为 颗 粒 性 抗 原 ， 当 与 相 应 的 抗 体 混 合 时 ， 在 一 定 浓 度 的 电 解 质 条 件下 ， 可 出 现 肉 眼 可 见 的 凝 集 现 象 。 玻 片 法 凝 集 实 验 是 用 诊 断 血 清 在 玻 片 上 与 待 测 细 菌 相 混 合 ， 在 电 解 质 存 在 下 ， 若 出 现 肉 眼 可 见 的 凝 集 小 块 即 为 阳 性 ， 表 示 该 菌 为 所 用 抗 体的 相 应 细 菌 。 此 法 是 一 种 定 性 实 验 ， 方 法 简 便 快 速 ， 特 异 性 强 。 可 用于 鉴 定 菌 种 及 菌 型 。 用 于 鉴 定 细 菌 的 诊 断 血 清 有 以 下 几 种 ： o 多 价 诊 断 血 清 ： 即 混 合 诊 断 血 清 。 该 血 清 含 有 两 种 （ 或 型 ） 以 上 细 菌的 相 应 抗 体 。 一 般 用 于 细 菌 定 群 或 初 步 分 型 。 o 单 价 诊 断 血 清 仅 含 一 种 （ 或 型 ） 细 菌 的 相 应 抗 体 。 可 用 于 细 菌 的 定 种（ 或 型 ） 。 o 因 子 诊 断 血 清 细 菌 含 有 多 种 抗 原 成 分 ， 而 且 不 同 菌 群 细 菌 之 间 可 有 共同 的 抗 原 成 分 。 因 此 ， 通 过 凝 集 吸 收 实 验 ， 将 抗 血 清 中 的 共 同 抗 体 除掉 ， 仅 含 一 种 特 异 性 抗 体 的 诊 断 血 清 称 为 因 子 血 清 。 可 用 于 细 菌 分 型 。