种子生活力测定的原理

2021-6-8 1 第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法一 、 种 子 生 活 力 的 概 念 和 测 定 意 义二 、 种 子 生 活 力 四 唑 染 色 测 定三 、 种 子 生 活 力 的 其 他 测 定 方 法 2021-6-8 2 1、种子生活力（seed viability）的概念 种 子 生 活 力 是 指 种 子 发 芽 的 潜 在 能 力 和 种 胚 所 具 有 的 生 命力 。 通 常 是 指 一 批 种 子 中 具 有 生 命 力 的 种 子 数 占 种 子 总 数 的百 分 率 。 一 、 种 子 生 活 力 的 概 念 和 测 定 意 义能 发 芽 的 种 子暂 时 不 能 发 芽 而 具 有 生 命 力 的 休 眠 种 子 2、测定种子生活力的意义（ 1） 休 眠 的 种 子 必 须 进 行 生 活 力 测 定（ 2） 快 速 预 测 种 子 发 芽 能 力 2021-6-8 4 二 、 种 子 生 活 力 四 唑 染 色 测 定（TTC test or TZ test） 1、发展简史l 1942年 由 德 国 H. Lakon发 明l 1950年 ISTA成 立 四 唑 测 定 技 术 委 员 会l 1953年 ISTA世 界 大 会 第 一 次 将 四 唑 测 定 列 入 国 际 种 子 检 验 规 程l 四 唑 测 定 手 册 （ Handbook on Tetrazolium Test） ， Moore，1984年 ， 650多 个 属 和 种l 1995年 我 国 将 四 唑 测 定 列 入 农 作 物 种 子 检 验 规 程 2021-6-8 5 无 色 的 的 三 苯 基 四 氮 唑 被 种 子 吸 收 后 ， 在 胚 部 活 细胞 中 脱 氢 酶 的 作 用 下 ， 还 原 成 为 红 色 的 、 稳 定 、 不 扩 散的 三 苯 基 甲 ， 这 样 ， 就 可 根 据 染 色 的 部 位 和 深 浅 来 区分 种 子 红 色 的 有 生 活 力 部 分 和 无 色 的 死 亡 部 分 。2、原理 2021-6-8 6 3、特点 原 理 可 靠 结 果 准 确 (与 标 准 发 芽 率 误 差 一 般 不 超 过 3-5%) 不 受 休 眠 限 制 简 便 快 速 6-24h Vitascope 20-30min 成 本 低 廉第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法 2021-6-8 7 测 定 休 眠 种 子 的 发 芽 潜 力 测 定 收 获 后 马 上 要 播 种 的 种 子 的 发 芽 潜 力 测 定 发 芽 缓 慢 的 种 子 的 发 芽 潜 力 测 定 发 芽 末 期 未 发 芽 种 子 的 生 活 力 测 定 种 子 收 获 或 加 工 期 间 损 伤 种 子 的 生 活 力 解 决 发 芽 期 间 遇 到 的 问 题 查 明 种 子 贮 藏 期 间 劣 变 衰 老 程 度 时 间 紧 迫 ， 调 种 时 快 速 测 定 种 子 生 活 力4、适应范围 2021-6-8 8 5、所需试剂 四 氮 唑 ： 2,3,5-氯 （ 溴 ） 化 三 苯 基 四 氮 唑 （ 2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride or Bromide） 简 称 ： 四 唑 或 红 四 唑 缩 写 ： TTC， TTB， TZ 理 化 性 质u 白 色 或 淡 黄 色 的 粉 剂 ， 熔 点 243 ；u 当 温 度 达 到 245 时 就 会 分 解 ， 易 溶 于 水 ， 具 有 微 毒 ；u 遇 到 直 射 光 线 时 会 被 还 原 成 粉 红 色 ， 所 以 该 试 剂 需 用 棕 色 瓶 装 盛 ， 并 用 黑 纸 外 面 包 装 。 已 配 好 的 四 唑 溶 液 应 装 入 棕 色 玻 璃 瓶 里 ， 存 放 在 暗 处 。 在 进 行 种 子 染 色 时 ， 也 许 将 其 放 在 暗 处 和 弱 光 处 进 行 。 2021-6-8 9 5、所需试剂 测 定 方 法l 建 议 使 用 0.1% 1.0% 四 唑 盐 的 水 溶 液 切 开 的 种 子 用 0.1% 0.5% 浓 度 的 四 唑 溶 液 ； 整 个 胚 、 整 粒 种 子 或 斜 切 、 横 切 或 穿 刺 的 种 子 需 用 1.0% 浓 度的 四 唑 溶 液 ； 种 子 染 色 时 间 与 四 唑 溶 液 浓 度 有 关 。 l 浓 度 增 加 ， 染 色 反 应 所 需 时 间 也 随 之 缩 短 ， 从 染 色 效 果 看 ， 以 较 低 浓 度 为 宜 ；l 测 定 时 ， 要 求 四 唑 溶 液 的 ph 值 在 6 7 范 围 之 内 。 2021-6-8 10 5、所需试剂 配 制 方 法l 称 取 1 g 四 唑 粉 剂 溶 解 于 100 ml 磷 酸 缓 冲 溶 液 中 ， 即 配 成 1.0% 四 唑 溶 液 ；l 称 取 0.1 g 四 唑 粉 剂 溶 解 于 100 ml 磷 酸 缓 冲 溶 液 中 ， 即 配 成 0.1% 四 唑 溶 液 ；l 可 用 NaOH 或 NaHCO3 溶 液 调 节 ph 值 。 2021-6-8 11 5、所需试剂 磷 酸 缓 冲 液u ISTA TZ手 册 法 u AOSA 规 程 法母液：称取 9.078 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）溶解于1000 ml 蒸馏水中；母液：称取 9.472 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）或 11.876 g Na2HPO4 2H2O 溶解于1000 ml 蒸馏水；然后取 2 份母液和 3 份母液混合即成。 在1000 ml 蒸馏水中加入 5.45 g NaH2PO4 和 3.79 g Na2HPO4 ，充分溶解即成。 2021-6-8 12 5、所需试剂 乳 酸 苯 酚 透 明 液 用 于 小 粒 豆 类 种 子 或 牧 草 种 子 ,染 色 后 种 皮 、 稃 壳 或 胚 乳 变 为 透 明 。 过 氧 化 氢 溶 液 用 于 某 些 牧 草 种 子 （ 黑 麦 草 ） 的 预 湿 浸 种 ， 加 快 酶 的 活 化 和 吸 胀 。 杀 菌 剂 和 抗 生 素 延 缓 衰 弱 种 子 的 劣 变 进 程 。 胶 液 硬 化 剂 有 些 种 子 浸 种 后 ， 种 皮 表 面 出 现 胶 液 而 变 得 非 常 光 滑 ， 难 以 拿 牢 进行 样 品 准 备 。 2021-6-8 13 6、测定程序（ 1） 预 处 理 l 预 措 ： 是 指 在 种 子 预 湿 前 除 去 种 子 外 部 的 附 属 物 和 在 种 子非 要 害 部 位 弄 破 种 皮 。l 预 湿 : 为 加 快 种 子 充 分 吸 湿 ， 软 化 种 皮 ， 便 于 样 品 准 备 ，以 提 高 染 色 的 均 匀 度 ， 通 常 种 子 在 染 色 前 要 进 行 预 湿 。 2021-6-8 14 6、测定程序l 预 湿（1）预处理u水 浸 快 速 预 湿 ： 适 合 于 水 稻 、 大 豆 和 花 生 等 作 物 种 子u纸 床 缓 慢 预 湿 ： 适 合 于 葱 、 玉 米 和 小 麦 等 作 物 种 子 纸 床 预 湿 (小 粒 豆 类 种 子 ) 纸 卷 预 湿 (大 豆 、 菜 豆 、 豌 豆 ）uH 2O2溶 液 浸 种 ： （ 为 了 加 快 种 子 吸 胀 和 促 进 酶 的 活 化 以 及缩 短 预 湿 时 间 ） 0.3%, 2030 , 1 h 农作物种子四唑染色技术规定 2021-6-8 15a) 不 需 预 湿 和 附 加 准 备 ： 如 苜 蓿 种 子b) 采 用 缓 慢 预 湿 后 不 需 样 品 准 备 ： 如 大 豆 种 子 等c) 穿 刺 或 切 开 胚 乳 ： 小 粒 牧 草 等 种 子d) 沿 胚 纵 切 ： 水 稻 、 玉 米 、 和 麦 类 等e) 近 胚 纵 切 ： 松 柏 和 伞 形 科 等 植 物 种 子f) 上 半 粒 纵 切 ： 莴 苣 和 其 他 菊 科 等 植 物 种 子 （2）染色前的样品准备目 的 ： 使 四 唑 溶 液 快 速 和 充 分 渗 入 种 子 全 部 活 组 织 ， 加 快 染 色 反应 ， 采 用 适 当 方 法 使 胚 的 主 要 构 造 和 活 的 营 养 组 织 暴 露 出 来 。 2021-6-8 16 g) 切 去 种 子 基 端 ： 茜 草 科 等 植 物 种 子h) 斜 切 种 子 ： 菊 科 、 十 字 花 科 和 蔷 薇 科 等i) 横 切 胚 乳 ： 黑 麦 草 、 羊 茅 等 植 物 种 子j) 剥 去 种 皮 ： 矮 牵 牛 、 茶 籽 和 棉 花 等 植 物 种 子k) 剥 开 胚 乳 取 出 胚 ： 杜 仲 等 林 木 种 子l) 横 切 胚 轴 和 盾 片 ： 大 麦 和 小 麦 等m) 从 果 实 内 取 出 胚 ： 桃 等n) 横 切 种 子 两 端 ： 山 茱 萸 和 胡 颓 子 等o) 平 切 果 种 皮 和 胚 乳 ， 露 出 胚 的 构 造 ： 洋 葱 和 菠 菜 等 植 物 种 子第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法（2）染色前的样品准备 2021-6-8 17 第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法1.禾 谷 类 :通 过 胚 和 约 在 胚 乳 四分 之 三 个 纵 切2.燕 麦 属 :靠 近 胚 部 横 切3.牧 草 :通 过 胚 乳 末 端 部 分 横 切和 纵 切4.牧 草 :种 子 刺 穿 胚 乳5.莴 苣 属 :通 过 子 叶 末 端 一 半 纵切6.第 5种 方 式 进 行 纵 切 时 的 解 剖刀 部 位 7.伞 形 科 :沿 胚 的 旁 边 纵 切8.针 叶 树 :种 子 沿 胚 旁 边 纵 切9.两 端 横 切 ,打 开 胚 腔 ,并 切 去小 部 分 胚 乳 . 2021-6-8 18 （3）染色温度和时间第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法l 将 准 备 好 的 种 子 样 品 放 入 染 色 盘 中 ， 加 入 适 宜 浓 度 的 四 唑 溶 液 完 全 淹 没 种子 ， 移 置 于 一 定 温 度 的 黑 暗 控 温 设 备 内 或 弱 光 下 进 行 染 色 反 应 。l 所 用 染 色 时 间 因 四 唑 溶 液 浓 度 、 温 度 、 种 子 种 类 、 样 品 准 备 方 法 等 因 素 的不 同 而 异 。l 在 20 45 范 围 内 ， 温 度 每 增 加 5 ， 其 染 色 时 间 可 减 少 一 半 。l 达 到 规 定 时 间 或 染 色 已 很 明 显 时 ， 倒 去 四 唑 溶 液 ， 用 清 水 冲 洗 。 l 已 达 到 规 定 时 间 ， 样 品 的 染 色 仍 不 够 充 分 ， 可 适 当 延 长 染 色 时 间 ， 以 便 证实 是 由 于 四 唑 溶 液 渗 入 缓 慢 引 起 ， 还 是 由 于 种 子 本 身 的 缺 陷 所 引 起 的 。 农作物种子四唑染色技术规定 2021-6-8 19 （4）鉴定前处理 直 接 观 察 ， 不 需 处 理 轻 压 出 胚 ， 观 察 鉴 定 扯 开 营 养 组 织 ， 暴 露 出 胚 切 去 一 层 营 养 组 织 ， 暴 露 出 胚 和 活 的 营 养 组 织 沿 胚 中 轴 纵 切 沿 种 子 中 线 纵 切 剥 去 半 透 明 的 种 皮 或 种 子 组 织 剥 去 种 皮 和 残 余 营 养 组 织 切 去 切 面 碎 片 或 掰 开 子 叶 乳 酸 苯 酚 透 明 液 的 应 用 (便 于 小 粒 种 子 观 察 ) 2021-6-8 20 目 标 ：（5）观察鉴定l 计 算 种 子 生 活 力 百 分 率l 按 染 色 程 度 和 组 织 特 性 ， 判 断 种 子 活 力 强 弱 ， 并 分 级l 查 明 种 子 劣 变 和 生 活 力 丧 失 的 原 因 2021-6-8 21l 裸 眼 或 在 解 剖 镜 下 逐 个 鉴 定 ， 分 清 健 壮 组 织 ， 衰 弱活 组 织 ， 衰 弱 死 组 织 和 死 亡 组 织 并 综 合 判 断 种 子 活力 第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法 鉴 定 ：（5）观察鉴定 2021-6-8 22 l 凡 是 胚 的 主 要 构 造 及 有 关 活 营 养 组 织 染 成 有 光 泽 的 鲜 红 色 ，且 组 织 状 态 正 常 的 ， 为 有 活 力 种 子l 凡 是 胚 的 主 要 构 造 局 部 不 染 色 或 染 色 成 异 常 的 颜 色 和 光 泽 ，并 且 活 营 养 组 织 不 染 成 部 分 已 超 过 二 分 之 一 ， 或 超 过 允 许 范围 且 组 织 软 化 的 ， 为 不 正 常 种 子l 凡 完 全 不 染 色 或 染 色 成 无 光 泽 的 淡 红 色 或 灰 白 色 ， 且 组 织 已腐 化 、 虫 蛀 、 损 伤 、 腐 烂 的 ， 为 死 种 子 。 l 各 种 植 物 的 种 子 活 力 判 别 标 准 参 照 种 子 检 验 规 程 。一 般 的 鉴 定 原 则 ： 2021-6-8 23 l 水 稻 ： 凡 是 胚 的 主 要 构 造 染 成 正 常 鲜 红 色 ， 或 胚 根 尖端 2/3不 染 色 而 其 他 部 分 正 常 染 色 的 种 子 为 有 生 活 力种 子 。l 大 豆 ： 凡 是 整 个 种 子 染 成 明 亮 红 色 ， 或 仅 胚 根 尖 端1/3不 染 色 ， 或 子 叶 表 面 有 小 范 围 坏 死 ， 或 子 叶 顶 端1/3不 染 色 ， 为 有 生 活 力 种 子 。 2021-6-8 24 （6）计算和结果表示第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法l 计 算 各 重 复 有 生 活 力 种 子 百 分 率 ， 重 复 间 误 差 不 得超 过 最 大 允 许 误 差l 结 果 计 算 到 近 似 整 数 生活力测定重复间的最大容许差距 种子检验结果报告单 2021-6-8 29 三 、 种 子 生 活 力 的 其 他 测 定 方 法l 甲 烯 兰 法l 溴 麝 香 草 酚 兰 法 （ BTB法 ）l 红 墨 水 染 色 法l 软射 线 造 影 技 术第 六 章 种 子 生 活 力 测 定 的 原 理 和 方 法