实验三蛋白质的性质实验

实验三实验三 蛋白质的性质实验蛋白质的性质实验(一一)蛋白质和氨基酸的呈色反应蛋白质和氨基酸的呈色反应1实验目的1.1.加深了解构成蛋白质的基本结构单位（加深了解构成蛋白质的基本结构单位（氨基酸氨基酸）和主要连接方式（和主要连接方式（肽键肽键）2.2.了解呈色反应原理了解呈色反应原理3.3.学习几种常用的鉴别蛋白质和氨基酸的方法学习几种常用的鉴别蛋白质和氨基酸的方法2#双缩脲反应双缩脲反应1 1）原理：）原理：将尿素加热到将尿素加热到180180，则两分子尿素缩合而成一分，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。（蛋白质分子中含有许多和应。（蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽双缩脲结构相似的肽键键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在的颜色在540nm540nm处比色，定量测定蛋白质）。处比色，定量测定蛋白质）。3#双缩脲反应双缩脲反应2 2）试剂：）试剂：（1 1）尿素）尿素 （2 2）10%10%氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 （3 3）1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液 （4 4）2%2%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液 2%2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1=1：9 9）4#双缩脲反应双缩脲反应3 3）操作：）操作：取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化，然后停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。尿素熔化，然后停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加冷后，加10%10%氢氧化化钠溶液氢氧化化钠溶液1010滴，振荡混匀，再加滴，振荡混匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，再振荡。观察出现的滴，再振荡。观察出现的粉红颜色粉红颜色。要避。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约向另一试管加卵清蛋白溶液约5 5滴和滴和10%10%氢氧化钠溶氢氧化钠溶液约液约1010滴，摇匀，再加滴，摇匀，再加1%1%硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加随摇。滴，随加随摇。观察观察紫玫瑰色紫玫瑰色的出现。的出现。5#双缩脲反应双缩脲反应4 4）注意事项：）注意事项：含有一个肽键和一个含有一个肽键和一个-CS-NH2,-CH2-NH2-CS-NH2,-CH2-NH2，-CRH-NH2-CRH-NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。因等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。6#茚三酮反应茚三酮反应1 1）原理：）原理：在加热条件下，所有氨基酸及具有游离在加热条件下，所有氨基酸及具有游离-氨基的氨基的肽与茚三酮反应都产生肽与茚三酮反应都产生蓝紫色蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。此反应十分灵敏，根氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，进行比色就可测定样品据反应所生成的蓝紫色的深浅，进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。氨基酸进行定性或定量分析。7#茚三酮反应茚三酮反应2 2）试剂：）试剂：（1 1）2%2%卵清蛋白卵清蛋白（2 2）0.5%0.5%甘氨酸溶液甘氨酸溶液（3 3）0.1%0.1%茚三酮茚三酮-乙醇溶液乙醇溶液8#茚三酮反应茚三酮反应3 3）操作：）操作：（1 1）取）取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液5 5滴，再各加滴，再各加2 2滴滴0.1%0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热加热1-21-2分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝。分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝。（2 2）在一小块滤纸上滴一滴）在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%缬氨酸溶液，风干缬氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。烘干显色，观察紫红色斑点的出现。9#茚三酮反应茚三酮反应4 4）注意事项：）注意事项：丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。因丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。性、定量测定中，应严防干扰物存在。此反应的适宜此反应的适宜pHpH为为5-75-7，同一浓度的蛋白质或氨基，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同酸在不同pHpH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。不显色。10#考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应1 1）原理：）原理：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250具有具有红色红色和和蓝色蓝色两种色调。在酸性两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。反应速度快，约在水作用结合后变为蓝色。反应速度快，约在2 2分钟左右分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01-1.0mg0.01-1.0mg蛋蛋白质范围内，蛋白质浓度与白质范围内，蛋白质浓度与A A595nm595nm值成正比。所以常用值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。来测定蛋白质含量。11#考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应2 2）试剂：）试剂：（1 1）2%2%卵清蛋白卵清蛋白 （2 2）考马斯亮蓝染液）考马斯亮蓝染液12#考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应3 3）操作：取）操作：取2 2支试管各加考马斯亮蓝染液支试管各加考马斯亮蓝染液5 5滴，再分别加滴，再分别加入入2 2滴滴2%2%卵清蛋白和卵清蛋白和2 2滴蒸馏水，观察两试管内液体颜滴蒸馏水，观察两试管内液体颜色变化。色变化。13