拟南芥叶片RNA提取实验指导

RNA 提取实验指导一、实验材料及试剂：1. 仪器与耗材冷冻离心机，20吐、200吐 枪头，1.5mL离心管、20吐、200吐、ImL 移液器，1L烧杯，研钵，研磨棒，研磨杵2. 试剂DEPC 1000倍稀释液，液氮，TRNzol-A+总RNA提取试剂，：氯仿、异丙醇、RNase-Free ddH2O 、 75%乙醇(用 RNase-Free ddH2O 配 制)。二、实验目的：提取拟南芥阳性植株的总RNA,拟进行RT-PCR检测，确定目的基因在拟 南芥中进行了表达。三、实验步骤：1. 样品处理取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在TRNzol-A+中研磨， 研磨要迅速，最好不要超过1 min。大约100 mg叶片使用1 ml TRNzol-A+。2. 将匀浆样品在15-30°C放置5 min,使得核酸蛋白复合物完全分离。3. 可选步骤：4C 12,000 rpm(13,400xg)离心 10 min，取上清。注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可 离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含 有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液 进行下一步操作。4. 每使用1 ml TRNzol-A+加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放 置3 min。注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀 2 min。5. 4C 12,000 rpm(13,400xg)离心10-15 min。样品会分成三层：黄色的有机相， 中间层 和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约500卩1)转移 到新管中。6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 min。7. 4C 12,000 rpm(13,400xg)离心10 min,去上清。离心前RNA沉淀经常是看 不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8. 加入 1 ml 75%乙醇(用 RNase-Free ddH2O 配制)洗涤沉淀。每使用 1 ml TRNzol-A+至少 用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。9. 4°C 5,000 rpm（2,300xg）离心3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少 量液体 短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。 10. 室温放置晾 干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即 可），根据实验需要，加入30-100卩1 RNase -Free ddH2 O,反复吹打、混匀， 充分溶解 RNA。10 .紫外分光光度计检测RNA浓度，将1 plRNA样液稀释至100卩1， 在紫外分光光度计测 A260、 A280 的 OD 值， 再根据它们的比值 确定浓度和纯度，而合格的DNA，其OD260/OD280 值应在1.8 2.0 之 间；注意事项：1. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70C放置一个月。2. RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8C一个星期以上或-20C一年。3. 若提取细菌RNA,推荐应用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂 盒（目录号： DP430）。预防RNase污染，应注意以下几方面：1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2. 使用 RNase-Free 的塑料制品和枪头避免交叉污染。3. RNA在TRNzol-A+试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中 应使用RNase- Free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4h，塑料器 皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min,然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase。4. 配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC至终浓度0.1%（V/V）,放置过夜，高压灭菌）。5. RNA提取过程中所有器材都经过RNase灭活处理，所用水皆用0.1% DEPC处理，所有溶液都用无RNase的水配置。离心管和枪头经过0.1% DEPC水溶液 浸泡12h，121 C高压灭菌30 min,玻璃器皿、研钵、杵、剪刀、镊子等在 180 C 烘烤 8 h。