蛙心灌流报告

蛙类离体心脏灌流院系：生命科学学院 实验人：张优13941202 邓晓娟13941201 （本次实验报告由张优执笔）一、实验目的1、学习斯氏离体蛙心灌流法。2、了解心肌的生理特性。3、观察Na+,K+,Ca2+及肾上腺素，乙酰胆碱对离体心脏活动的影响。二、实验原理（一）两栖类动物无冠状循环两栖类动物无冠状循环，心肌直接从流经心腔的血流中获取营养。即心室肌直接 从心室腔中获得营养。故用任氏液置换心室中的血液后，心室插管中的灌流液便 成为心室肌的细胞外液。（二）心肌对细胞外离子浓度和体液因数敏感（三）钾、钙和钠离子对心肌特性的影响1. 血钾浓度过高时（高于7.9mmol/L）,心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩 性都下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张 期。2. 血钙 浓度升高时，心脏收缩力增强，过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度 降低，心肌收缩力减弱。3钠离子 浓度的轻微变化，对心肌影响不明显，只有发生明显变化时，才会影 响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强，乙酰 胆碱则与肾上腺素的作用相反。三、实验材料青蛙、常用手术器械、蜡盘、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、 双凹夹、滴管、小烧杯、纱布、棉线、任氏液、蛙心套管、套管夹、0. 65%NaCl、 5%NaCI、2%CaCl2、1%KCl、1： 5 000 肾上腺素、1： 10 000 乙酰肌碱、300U /mL肝素。四、实验步骤（一）蛙心的解剖1. 毁脑毁脊髓2. 打开胸腔3剪开心包膜、暴露心脏（二）斯氏蛙心插管法1. 结扎左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎。左右两主动脉下方穿一线，并打一活 结备用。2插管左主动脉结扎处下方用眼科剪剪一小切口，将盛有任氏液+少量肝素的蛙心插管由此口插入主动脉，至动脉圆锥时约“向 后向下向前”试插，当心室收缩时容易 经主动脉瓣插入心室腔内。3. 心脏离体稳定套管后，轻轻提起备用线，将左、 右主动脉连同插入的套管用双结扎紧， 将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后 剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管 和心脏，于静脉窦下方剪断有牵连的组 织，使心脏离体。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血 液。保持套管内液面高度一致2 cm。4. 支架固定 将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉。再将蛙心 夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。张力传感器与计算机采集系统相 连。如右图。(三) 实验观察操作(1) 记录正常心搏曲线。(2) 将蛙心插管0. 65%NaCl溶液全部进行灌流，液面高度不变，并作好标记， 观察用简单的生理盐水取代任氏液后心脏活动的变化。待心搏曲线出现明显变化 时，立即吸去插管中的灌流液，同时作好冲洗标记，并用正常、干净的任氏液清 洗23次，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。(3) 在插管内正常任氏液的基础上，加入2滴5%NaCl溶液，作好加药标记，观 察心搏曲线的频率及振幅的变化。当曲线出现明显变化时，立即吸去插管中的灌 流液，用干净任氏液清洗3次，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。(4) 向插管内加入半滴2%CaCl2溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明 显变化时，立即更换任氏液(方法同上)，清洗，待心搏恢复正常或接近正常， 并保持稳定。(5) 向插管中加半滴1%KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时， 立即同法更换灌流液，清洗，待心搏恢复正常或接近正常，并保持稳定。(6) 同法记录插管中加入半滴1 ： 5000肾上腺素溶液后心搏曲线的变化。(7) 同法记录插管中加入半滴1 ： 10000乙酰胆碱溶液后心搏曲线的变化。五、实验结果及分析1、正常博击曲线图值值值值 丈小峰均 盘盘烽平(£(2 7(112 5 6方式速度（s/div）灵敏度（g）频率（Hz）张力23102、滴加0. 65%NaCl溶液图方式速度（s/div）灵敏度（g）频率（Hz）张力2310滴加0.65%NaCl溶液后，心跳减弱，这是由于用0.65%NaCl溶液灌注蛙心时, 由于灌注液中缺乏Ca2+,以致心肌细胞动作电位2期内流Ca2+减少,细胞质Ca2+ 浓度减少，心肌的收缩活动也随之减弱。3. 滴加5%NaCl溶液joi氯化纳1n. . A n J亘扌方式I速度（s/div灵敏度（g）频率（Hz）张力5310杲大值:-1.80 （g）由于细胞外液噩能浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明显。因此上图 的心率变化与滴加加0S65%NOCl溶液里变化并不是很大，两个不同浓度的相同溶液 作用机理是一样的。但如果实验中滴加溶液顺序不一样，若先滴加5%NaCl.再滴加0.65%NaCl溶液，所得的心搏变化就不如图3那样明显了，收缩力仅出现很微弱的变化。4滴加2%CaCi溶液4D3亜披酒磁方式张力平均疸12 9 B421B z ill速度（s/div）5灵敏度（g）1.5频率（Hz）10细胞外Ca2+在细胞膜上对Na+内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。Ca2 +。增高时，Na +内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，使兴奋性及传导 性均降低。Ca2+增高使Ca2 +内流增多，因此慢反应细胞0期去极化加快加强, 传导性增高，而快0反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca2 +内流 增多，使心肌收缩能力增强。Ca2+降低时，所引起的变化与高钙时相反。因 此加入CaCl后，心率减少、振幅减少，基线上移。25滴加1%KCl溶液1.02氯;化钾；03更换溶液值值值值 大小煌均 摄h7 1 6 _y3 6 T 11. 1. 1. 1. s s s S速度（s/div）灵敏度（g）频率（Hz）10滴加1%后的心搏曲线发现，曲线的频率逐渐减小，愈来愈疏，幅度逐渐下 降F后停止在基线处，即心脏停博于舒张状态。因为当细胞K+浓度增高时， K+与Ca2+有竞争性拮抗作用，K+抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进入细胞内Ca2+ 减少，心肌的兴奋一收缩偶联过程减弱，心肌收缩力降低。所以心搏曲线振幅减 小。6滴加1： 10000肾上腺素溶液式力方张9 5fl T5 1 (1 (1速度(s/div)5灵敏度（g）3频率（Hz）101 口塞滴加肾上腺素后，蛙心收缩增强，心脏舒张完全，描记的心搏曲线幅度明显 增大。其作用机理是，肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合，提高心肌细胞 和肌浆网膜Ca2+通透性，导致肌浆中Ca2+浓度增高，使心肌收缩增强。另外， 肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Ca2+亲和力，促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增 加，提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度，刺激Na+与Ca2+交换，使复极期向细胞外 排出Ca2+的作用加速，这样，将使心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显增强。 7滴加1： 10000乙酰胆碱溶液摄犬值:1.22 (g) 摄小值:-6. 00 (g) 嶂烽值:7. 22 (g)平均值:-3. 58 (g)'I1Ue、亠 tv力式速度（s/div）灵敏度（g）频率（Hz）张力5610蛙心收缩减弱，心率减慢，最后出现蛙心停止舒张阶段。其机理为：乙酰胆 碱与心肌细胞膜M受体结合，一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性，促使K+ 外流，将引起：1）窦房强细胞复极时K+外流增多，最大复极电位绝对值增大； Ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房自律性降低，心 率减慢。2）复极过程中K+外流增加，动作电位2、3期缩短，Ca2+进入细胞内 减少，使心肌收缩减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制Ca2+通道，减少Ca2+内 流，进而使心肌收缩减弱。六、实验讨论1.思考题:各种离子成分改变蛙心收缩的原理是什么？答：由于心肌细胞生物电活动和收缩过程与离子密切相关，因此，细胞外液中离 子浓度升高或降低均会影响到心肌的电生理特性和收缩性。（1）钾离子的影响K+与静息电位的形成有关。细胞外液K+浓度K+变化对0心肌生理特性的影响较为复杂。高钾：K+轻度或中度增高时，膜内、外K+浓0度差减小，静息电位绝对值减小，与阈电位差距缩短，因此，兴奋性增高。K +显著升高时，由于静息电位绝对值减小过多(膜内达-55mV左右)，Na+通道 0失活，因而兴奋性降低甚至消失。另外，还使0期去极化速度和幅度减小，传导 性降低，导致兴奋传导减慢，甚至传导阻滞。此外，K+增高还可提高膜对K 0+的通透性，加速K+外流，动作电位平台期缩短，因此，不应期缩短。此外由于 平台期缩短，减少了 Ca2 +的内流，加上细胞外K+与Ca2+在膜上有竞争性抑制作 用，导致心肌收缩功能减弱；(2) 钙离子的影响 细胞外Ca2+在细胞膜上对Na+内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。Ca2+增高时，Na+内流受抑制，细胞0期除极速度与幅度减小，0使兴奋性及传导性均降低。Ca2+增高使Ca2 +内流增多，因此慢反应细胞0期0去极化加快加强，传导性增高，而快反应细胞平台期缩短，有效不应期缩短，复极加速。Ca2 +内流增多，使心肌收缩能力增强。Ca2+降低时，所引起的变化0与高钙时相反。(3) 钠离子的影响 细胞外液中钠浓度差梯度的变化一般对心肌活动影响不明 显。只有当Na+明显增高时，膜内外钠的浓度差梯度增大，因此，快反应细0胞Na+内流加快，0期去极速度和幅度均增加，导致传导性和自律性增高。同时，Na+内流的增多促进细胞内Ca2+的外运使细胞内Ca2+浓度降低，因此，心肌收缩 能力减弱。反之，当Na+降低，使心肌传导性和自律性降低，心肌收缩能力 0增强。2.实验注意1) .制备蛙心标本时，勿伤及静脉窦。2) 上述各实验项目，一旦出现作用应立即用正常任氏液换洗，以免心肌受损， 而且必须待心搏恢复正常后方能进行下一步实验。3) 复习心肌生物电的产生机制及各种离子对心脏活动的影响。4. )尽量选用健壮、体大的雄性蟾蜍，手术过程中注意保护心脏，避免损伤。5) 实验中及时用任氏液冲洗心脏，待曲线恢复平稳后再进行下一步操作。6) 每次更换任氏液都必须保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量变化而影 响结果。7) 严格控制每次药品加入量，先加一滴，效果不明显再加一滴。8) .滴加药品和换取正常任氏液，须及时标记，以便观察分析。9) 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管内溶液的吸管应区分专用，不可混淆使用， 以免影响实验结果。七、参考文献【1】项辉，龙天澄等.生理学实验指南M.科学出版社，2008 : 21- 38.【2】朱大年生理学M.人民卫生出版社，2008： 6-8.