响应面对里氏木霉产纤维素酶液体发酵条件的优化

响应面对里氏木霉产纤维素酶液体发酵条件的优化摘要：采用单因素试验和响应面法对里氏木霉 （Trichoderma reesei） RutC-30 产纤维素酶的液体发酵条件 进行优化并以滤纸酶活力（FPA ）作为响应值。结果表明， 最优发酵条件为玉米芯粉 3.42%，牛肉膏添加量 1.70%，吐 温-80添加量0.08%，初始pH 5.04，此条件下发酵液中的滤 纸酶活力为12.10 U/mL,较未优化条件下得到的最高酶活力 7.03 U/mL 提高了 72.12%。关键词：里氏木霉（Trichoderma reesei）；玉米芯粉；纤 维素酶；酶活；液体发酵；响应面中图分类号： TQ925 文献标识码： A 文章编号： 0439-8114（2015） 15-3735-06DOI： 10.14088/ki.issn0439-8114.2015.15.040Abstract： Single-factor tests and response surface methodology， with filter paper activity （ FPA） as response value， were used to optimize the liquid-state fermentation medium for cellulase production by Trichoderma reesei RutC-30.The results showed that the optimum medium was composed of corncob powder 3.42%， beef extract 1.70%， and Tween-80 0.08% with initial pH 5.04. Under this condition， the FPA reached to 12.10 U/mL and increased by 72.12%，compared with the maximum FPA (7.03 U/mL) before optimization.Key words：Trichoderma reesei；corncob powder； cellulase；enzyme activity；liquid-state fermentation；response surface methodology植物纤维素类资源被统称为生物质资源，主要包括农 林、固体及能源作物废弃物，其中农林废弃物(如麦秆、麸 皮、玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣、森林采伐加工剩余物等) 中含有最丰富的纤维素类可再生资源1-4。中国是玉米种植 第二大国，且在粮食作物总产量中占有很大比例5-7。玉米 芯中含有丰富的营养成分，但因其适口性和营养性差，在饲 料行业中未能得到有效的利用，随着科技不断更新，玉米芯 诸多潜在功能与价值逐渐被开发出来8。玉米芯资源价格低 廉，其综合利用可以缓解因燃烧而引起的环境污染问题，具 有不可估量的生态效益、经济效益与社会效益8-11。本试 验利用纤维素酶工业高产丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei) 12，采用液体发酵的方式，以玉米芯粉为发酵底物 对产纤维素酶条件进行优化，以期为玉米芯粉更好地产纤维 素酶利用提供依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌株 里氏木霉RutC-30,由中国科学院微生物研究所提供。1.1.2 主要仪器与设备 GSKP-01BII 型隔水式电热恒温 培养箱，湖北省黄石市医疗器械厂；MaxQ摇床、ST16R台 式高速冷冻离心机，美国 Thermo Scientific 公司； HH-6 数显 恒温水浴锅，国华电器有限公司； UV-6 1 00型紫外可见分光 光度计，上海美谱达仪器有限公司； Delta-320 型 pH 计，瑞 士 Mettler-Toledo 有限公司。1.1.3 主要材料与试剂 玉米芯粉：取玉米田地中自然风 干的玉米芯铡成小块烘干，用粉碎机粉碎后过筛（1.0 mm）； 吐温-80：分析纯，成都康迪生物技术有限公司； 0.05 mol/L、 pH 4.8柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，DNS试剂。1.1.4培养基PDA斜面；MM培养基：葡萄糖20 g，硫 酸铵5.0 g，KH2PO4 15 g， MgSO4?7H2O 0.6 g，CaCl2 0.45 g， CoCl2?6H20 3.7 mg， FeSO4?7H2O 5 mg， ZnSO4?7H2O 1.4 mg，MnSO4?H2O 1.6 mg，加去离子水至 1 000 mL，pH 自 然；基础产酶培养基：将MM培养基中葡萄糖等量换成微晶 纤维素即可。1.2 方法1.2.1 菌株活化与扩大培养 将冷藏菌接种在新鲜 PDA 平板上，30 °C活化培养，待产抱后，取1 mL 1X107个/mL 的抱子悬液接入装有50 mL MM培养基中，180 r/min、30 C 恒温培养72 h，待产菌丝。1.2.2 产酶培养及粗酶液提取 2 层纱布过滤菌丝并称取 1 g （湿重）菌丝，接种到50 mL基础产酶发酵培养基中，180 r/min、30 °C振荡培养5 d。发酵液于4 °C、8 000 r/min离心 10 min, 上清即为粗酶液。1.2.3 酶活力测定 滤纸酶活力（ Filter Paper Activity，FPA）测定13：将新华滤纸裁成6 cmX 1 cm的长方形，卷 成圆筒状置于试管底部，加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 1.8 mL, 50 C预热5 min,再加入稀释酶液0.2 mL （空白对照 加等体积灭活酶液），50 C水浴保温60 min后，迅速冷却。 加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min后迅速冷却，补加去离 子水至25 mL，摇匀静置，于540 nm处测定吸光值。酶活定义：在试验条件下，1 mL酶液1 min水解底物生 成1 “g还原糖（以葡萄糖计）所需酶量为一个酶活力单位 （U/mL）。1.2.4产酶条件优化 单因素试验。保持其他因素不变，考察碳源（玉米芯粉、麸皮、微晶纤维素、 乳糖、甘油、葡萄糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、 硫酸铵、尿素、硝酸钠）、吐温-80添加量、产酶初始pH以 及氮源与碳源添加量对里氏木霉RutC-30发酵产纤维素酶活 力的影响。响应面优化试验。在单因素试验的基础上，应 用 Box-Behnken 设计 4 因素 3 水平试验，响应面分析优化里 氏木霉RutC-30产纤维素酶发酵条件，并进行最优验证试验。2 结果与分析2.1 单因素试验结果2.1.1 最优碳源及其最适添加量 在基础产酶培养基中 分别添加2.0%的不同碳源并测定其FPA,结果（图1）表明, 玉米芯粉、麸皮对里氏木霉 RutC-30 产纤维素酶都有明显的 诱导效果，其中玉米芯粉效果最佳。因此选取玉米芯粉为碳 源，考察玉米芯粉不同添加量（m/V, g： mL,下同）对里 氏木霉RutC-30产纤维素酶的影响，结果见图2。由图2可 知，当玉米芯粉添加量为3.5%时，发酵液中的FPA最高。2.1.2 最优氮源及其最适添加量 向基础产酶培养基中 分别添加0.5%的氮源，测定发酵液中纤维素酶活力。结果（图 3）表明，有机氮源较无机氮源对里氏木霉RutC-30产纤维素 酶有更好的效果，其中牛肉膏对产酶效果最佳。在基础培养 基中依次加入不同量牛肉膏，确定牛肉膏的最适添加量（m/V， g： mL，下同），结果见图4。由图4可知，当牛肉 膏添加量为2.0%时，发酵液中FPA最高。2.1.3 最优吐温-80添加量 在基础产酶培养基中加入不 同质量的吐温-80,测定其对里氏木霉RutC-30产纤维素酶的 影响，结果如图5所示。由图5可知，当吐温-80添加量（m/V， g： mL，下同）较少时，发酵液中纤维素酶活力逐渐增高， 当添加量为0.12%时，发酵液中的FPA最高，较未添加条件 下酶活力提高了48.46%，继续增加吐温-80酶活力反而下降。2.1.4 最优产酶初始 pH 设定其他因素不变，调节基础 产酶培养基初始pH并检测不同pH条件下发酵液中纤维素酶 活力，结果见图 6。由图 6 可知，当基础产酶培养基的初始 pH 为 5.0 时，发酵液中纤维素酶活力最高。2.2 响应面优化结果2.2.1 Box-Behnken 试验设计与结果 在单因素试验基础 上，应用 Box-Behnken 设计 4 因素 3 水平试验，因素与水平 见表 1，结果见表 2。2.2.2 数学模型建立及显著性检验分析 根据 Design Expert 8.0.5b 软件对表 2 中试验结果进行二次线性回归方程 拟合，得到数学模型：Y=14.51-1.53A-2.61B-0.40C+0.58D-3.31AB+3.12AC-0.68AD +1.30BC+2.04BD-1.55CD-4.38A2-1.51B2-1.05C2-1.38D2。由表3可知，模型显著（P0.05,说明模型拟合程度较好 且失拟不显著，预测值与实际值间具有高度的相关性。由响 应面分析 F 可知，各因素对里氏木霉 RutC-30 发酵产纤维素 酶活力影响的主次顺序为牛肉膏、玉米芯粉、初始pH、吐 温-80。2.2.3 培养基的响应面优化与分析 利用 Design Expert 8.0.5b 软件对数据进行分析得到响应面及等高线图，各因素 间交互作用对响应值的影响可直观地反映出来。其中等高线 的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素间的交 互作用显著，相反，圆形则表示不显著14， 15。具体响应 面优化分析见图 7-图12。由图7 可知，设定吐温-80 添加量 及初始 pH 均为最优水平。当玉米芯粉加入量为某一值时， 牛肉膏添加量为1.70%时FPA最高；当牛肉膏添加量为某一 值时，随着玉米芯粉添加量的逐渐增加，FPA呈现先增高后 降低的趋势。由等高线图可知，两因素交互作用明显且达到 显著水平(P=0.032 6)。再由等高线变化密集度可知，玉米 芯粉添加量对FPA的影响强于牛肉膏添加量。由图8可知，设定牛肉膏添加量及初始pH均为最优水 平。当玉米芯粉加入量为某一值时，随着吐温-80添加量的 逐渐增加，FPA逐渐增高，当其添加量为0.08%时，FPA最 高；当吐温-80添加量一定时，FPA随着玉米芯粉添加量的 逐渐增加而出现先增高后降低的趋势。由等高线图可知，玉 米芯粉添加量与吐温添加量交互作用明显且达到显著水平 (P=0.041 8)。再由等高线变化密集度可知，玉米芯粉添加 量对FPA的影响强于吐温-80。由图 9可知，设定牛肉膏添加量及吐温-80添加量均为 最优水平。当玉米芯粉添加量为某一值时，随着初始pH的 逐渐增加，FPA呈现先增高后降低的趋势；当初始pH为某 一值时，随着玉米芯粉添加量的逐渐增加，FPA也出现先增 高后降低的趋势。由等高线图中等高线形似圆形，表明玉米 芯粉添加量与初始pH交互作用明显但未达到显著水平 (P=0.631 3)。由等高线图等高线变化密集度可知，玉米芯 粉添加量对FPA的影响强于初始pH。由图10可知，设定玉米芯粉添加量及初始pH均为最优 水平。当牛肉膏添加量为某一值时，吐温-80添加量为0.08% 时，FPA最高；当吐温-80添加量为某一值时，随着牛肉膏 添加量的逐渐增加，FPA逐渐降低，加入1.70%牛肉膏时， FPA最高。由等高线图可知，牛肉膏添加量与吐温-80添加 量交互作用明显但未达到显著水平(P=0.352 0)。由等高线 图等高线变化密集度可知，牛肉膏添加量对FPA的影响强于 吐温-80 添加量。由图11可知，设定玉米芯粉添加量及吐温-80添加量均 为最优水平。当牛肉膏添加量为某一值时，随着初始pH的 逐渐增加，FPA呈现先增高后降低的趋势；当初始pH为某 一值时，随着牛肉膏添加量的逐渐增加，FPA逐渐降低，牛 肉膏添加量为1.70%时，FPA最高。由等高线图可知，牛肉 膏添加量与吐温-80添加量交互作用明显但未达到显著水平 (P=0.162 5)。由等高线图等高线变化密集度可知，牛肉膏 添加量对FPA的影响强于初始pH。由图12可知，设定玉米芯粉添加量及牛肉膏添加量均为最优水平。当吐温 -80添加量为某一值时，FPA随着初始pH的逐渐增加而呈现 先增高后降低的趋势；当初始pH为某一值时，吐温-80添加 量为0.08%时，FPA最高。由等高线图可知，吐温-80添加量 与初始pH交互作用明显但未达到显著水平(P=0.281 0)。由 等高线图等高线变化密集度可知，初始pH对FPA的影响强 于吐温-80 添加量。2.2.4 最优发酵条件验证结果 由 Design Expert 8.0.5b 软 件分析可知最优发酵条件为玉米芯粉 3.42%、牛肉膏添加量 1.70%、吐温-80添加量0.08%、pH 5.04时，预测FPA最高 为16.40 U/mL。为了检验模型预测的准确性，依据响应面试 验优化得到的培养基组成进行验证试验，得到FPA为12.10 U/mL，较未优化的条件得到的最高酶活力7.03 U/mL提高了 72.12%，与模型预测值符合度为 73.78%。3 结论相比于固体发酵，液体发酵更适合于工业的大规模生产11。本试验中利用农田地里自然风干的玉米芯，经过粉碎 制得玉米芯粉后直接用于试验研究，并得到了较好的试验效 果，减少了因对玉米芯前处理而带来的资源及成本的浪费12。吐温-80 是一种良好的细胞表面活性剂，因能改变细胞 膜的通透性而有效促进胞内蛋白的释放16。刘佳等17添加 临界胶束浓度的吐温- 80 后使酶活提高了 31.8%；王亚林等 18使用土温-80后FPA提高了 29.6%；本试验中添加0.12% 吐温-80 时酶活力提高了 48.46%。可见吐温-80 对里氏木霉 RutC-30 液体发酵产纤维素酶有较好的促进作用。响应面法(Response surface analysis，RSA)是数学方法 和统计方法结合的产物19，具有减少试验次数，缩短试验 周期，回归方程精度高，并能直观反映因素间的交互作用等 特点；可同时对影响试验的多因素间的交互作用进行优化与 评估，精确反馈因素与响应值间的关系，并得到最佳的发酵 条件。RSA是目前微生物发酵条件优化常用的方法。冯培勇 等20经响应面条件优化酶活力提高了 34.4%。本试验中较 未优化条件下FPA提高了 72.12%。参考文献：1 HARTLY B S， BRODA P M A， SENIOR P J.Technology in the 1990s： Utilization of lignocellulosic wastesM. 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