Bradford法测蛋白质浓度的步骤1

Bradford法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为 0.10mg/ml , 0.08mg/ml, 0.06mg/ml , 0.04mg/ml , 0.02mg/ml, 0 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到 蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据 标准曲线得到蛋白质的浓度。二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在 游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白 质一色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正 比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试 剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可 测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000pg/ml，是一种常用的 微量蛋白质快速测定方法。三、实验过程1. 准备所需的药品和仪器。2. 计算所需配制的溶液的量。先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液 （PBS）配制一组浓度分别为 1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml ， 0.4mg/ml ， 0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml 的 BSA 溶液。计 算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。BSA体积(ul)10080604020PBS体积(ul)900920940960980BSA浓度 (mg/ml)1.00.80.60.40.23. 具体操作过程。用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶 液，溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的 BSA 溶液，置于 1.5ml 的 EP 管中，再分别加入 900ul，920ul，940ul，960ul，980ul 的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为 1.0mg/ml , 0.8mg/ml, 0.6mg/ml , 0.4mg/ml , 0.2mg/ml 的 BSA 溶液。移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各 加入900ul的PBS溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10 mg/ml , 0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml 的 BSA 溶液。另外量取 1ml 的PBS溶液（BSA溶液浓度为0 mg/ml）作对照试验。用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入 200ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸 光度。四、实验数据及处理测得的BSA溶液的吸光度如下:BSA浓度（mg/ml）0.100.080.060.040.020吸光度0.9710.9230.8740.8470.7460.650用orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。y=3.0Sx+0.68071.0-R =0 95410.90.7-0.6 I i |i |,|i i ii0.000s020,040,060.0&0.10BSA浓度 mg/ml五、实验结果分析得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807, R2=0.9541。可以 看出吸光度一浓度的关系曲线中R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是 很好。