实验一植物中总糖的测定

实验一植物中总糖的测定-3, 5-二硝基水杨酸比色法实验目的(1) 掌握总糖定量测定的基本原理(2) 熟悉3, 5-二硝基水杨酸定糖法的基本操作实验原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解性质不同， 可将植物样品中的单糖、双糖、多糖分别提取出来。再用水解法使没有还原性的 双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖与3, 5-二硝基水杨酸共热，3, 5-二硝基水杨酸被还 原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其他产物。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成比例关系，在540nm波 长下测定棕红色物质的吸光度，通过标准曲线，便可求出样品中总糖的含量。多 糖水解时，在单糖残基上加了一个分子水，因而在计算中需扣除已经加入的水量， 测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖含量。实验材料、仪器与试剂1. 实验材料面粉2. 实验仪器刻度试管或比色管，刻度吸管，恒温水浴锅，烧杯，容量瓶，电子天平，分 光光度计，三角瓶。3. 试剂(1) 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取500mg分析纯葡萄糖，置于烧杯中， 用少量蒸馏水溶解后，定量转移到500ml的容量瓶中。以蒸馏水定容至刻度，摇 匀，冰箱中保存备用。(2) a:3, 5-二硝基水杨酸试剂：取6.5g3, 5-二硝基水杨酸溶于少量热蒸馏水 中，溶后移入1000ml容量瓶中，加入325ml 2mol/L氢氧化钠溶液，再加入45g 丙三醇，摇匀，冷却，定容至1000ml。b:3, 5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3, 5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L 氢氧化钠溶液加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和 5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，储于棕色瓶中备用。(3) 碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。(4) 酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml70%乙醇中。(5) 6mol/L盐酸溶液(6) 6mol/L氢氧化钠溶液操作步骤1.葡萄糖标准曲线制作取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄 糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反 应液。将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后用自来水冷却至室温，加蒸馏 水定容至25ml，混匀。在540nm波长下，以0号管为对照，分别测定其它六支管的吸光度，并绘制标准曲线。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/ml葡萄糖标 准液(ml)蒸馏水(ml)DNS (ml)葡萄糖含量(mg)吸光度 (OD540)0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.22.总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl,置于沸水中加热水解30min。取1-2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘- 碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已完全水解，则不显蓝色。待三角瓶中的水 解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/L NaOH中和至微红色，用蒸馏水 定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另 一 100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。表2样品总糖测定管号总糖待测 液(ml)蒸馏水(ml)DNS (ml)光密度值 (OD540)查曲线葡萄糖量(mg)7111.58111.59111.5按表2加入试剂后，其余操作与制作标准曲线相同。以制作标准曲线时的0 号管为对照，测定各管吸光度，取平均值。结果与计算在标准曲线上查出相应的总糖的浓度，按下式计算面粉中总糖的含量。样品质量(g) X1000查曲线所得总糖含量(mg) x提取液总、量$稀释倍数x0.9 总糖(%) =测定时取用量 X100注意事项(1) 样品量和稀释倍数的确定，要考虑本方法的检测范围，待测液的含糖 量要在标准曲线范围内。(2) 标准曲线的制作与样品的测定要在相同条件下进行，最好是同时进行 显色和比色。思考题(1) 本实验中引起误差的原因有哪些？(2) 为什么说总糖的测定通常是以还原糖的测定方法为基础的？