表型及复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因研究0001

大肠埃希菌连续分离株耐药表型及复方磺胺甲口 恶唑耐药相关基因研究作者：王伟糜祖煌毛剑锋徐伟珍【摘要】目的了解临床分离的大肠埃希菌耐药性和复方磺胺甲口恶唑 (SMZ/TMP)耐药相关基因存在状况。方法测定临床连续分离的60株大肠埃希 菌 对19种抗菌药物的敏感，性采用聚合酶链反应(PCR)检测SMZ/TMP耐药相关 基因(sull、dfrAl、dfrA17)。结果 60 株中 sull、dfrAl、dfrA17 基因阳性分别 为34株(56. 7%)、1株(1.7%)、35株(58. 3%)。结论临床分离的大肠埃希菌多 重耐药严重；复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因携带率高。【关键词】大肠埃希菌；复方磺胺甲口恶唑；耐药基因ABSTRACT Objective To investigate the drug resistance and drug resistance related trimethoprim sulfamethoxazole genes in Excherichia coli. Method Microdilution tests were performed to detect susceptibility of 60 strains of Escherichia coli to 19 antimicrobial agents and drug resistance related trimethoprim sulfamethoxazole wore detected by PCR. Result The positive rates of sull, dfrAl and dfrA17 genes in 60 clinical strains of Escherichia coli were 56. 7%, 1.7%, 58.3%，respectively. Conclusions There are multiple drug resistance and high positive rate of drug resistance related trimethoprim sulfamethoxazde genes in Rschcrichia coli isolated from the hospital.KEY WORDS Escherichia coli; Trimethoprim sulfamethoxazole; Resistant genes多年来，大肠埃希菌(Escherichia coli，EC)一直是医院感染的重要病 原菌之一。EC菌对p内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐 药性，相关耐药基因研究已有报道。经检索国内尚无EC菌的复方磺胺甲口恶 唑(SMZ/TMP)耐药相关基因报道。我们对60株连续分离株EC菌进行了药敏表 型检测，并进行了 SMZ/TMP耐药相关基因sull、dfrAl, dfrA17检测，现报道如下。1材料与方法1. 1菌株来源60株EC菌均分离自2006年08月 2006年12月间丽水市人民医院住院患者临床标本，其中痰液10例，尿液24例，血液2例，分泌物24例(脓液15例、腹水4例、引流液3例、咽拭子2例)。全部菌株用 Bio Merieux ATB细菌鉴定仪鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922 和铜绿假单胞菌ATCC27853。1.2抗菌药物敏感性试验用微量肉汤稀释法测定19种抗菌药物的敏感性，并根据美国CLSI 2006 年 版要求进行敏感性判断。1.3细菌处理 挑纯培养菌落置入0. 5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋 白酶K溶液200J 156OC水浴 才然后95OC水浴lOmin，加入Chelex 100树 酯40 P 1,离心(15000r/min)30s。上清液即为基因检测的模板液，2)对冰箱 保存备用。1.4基因检测用聚合酶链反应法(PCR)进行检测。PCR引物序列见表1。PCR扩增体系 为:每反应体系 PI、P2 引物各 0. 5(J mol, dNTPs 各 200mmol, KC1 lOmmol, (NH4)2S04 8mmol, MgC12 2mmol, Tris 11C1 (pll9. 0) lOminoi, NP40 0.5% BSA 0.02%(wt/vol), Taq DNA pol 1U；总反应体积 2J1(其中模板 液5J 1) 。热 循环参数为：93°C预变性2min,然后93°C30s-55°C30s-72°C60s，循环35周 期，再72OC延仲5min。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照 DNA 由无锡市克隆遗传技术研究所提供(表1)。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫 外凝胶电泳成像仪下观察，并纪录结果。表1 sull、dfrAl、dfrA17基因PCR 引物序列及产物长度2结果2.1药敏试验结果60株EC菌连续分离株对亚胺培南和美罗培南敏感。对头孢他啶、阿莫西 林/克拉维酸、头孢西丁、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/三唑巴坦等 6种抗菌药物的敏感率在53. 3%95%;对头孢噻肟、头孢呋辛、妥布霉素、庆 大霉素、环丙沙星、哌拉西林、阿莫西林和替卡西林等8种抗菌药物的耐药率 在50%90%。对复方磺胺甲口恶唑的耐药率为66. 7%。2.2 sull、dfrAl、dfrA17 基因sull、dfrAl、dfrA17 基因阳性率分别为 56. 7%(34/60)、1.7%(1/60)、58. 3% (35/60) o 有 35 株检出 dfrA 基因(58. 3%), 40 株检出 sul 和(或)dfrA 基 因(66. 7%)。图1为sull基因PCR产物电泳图。dfrA17基因PCR产物经测序 与美国GenBank核酸数据库中已登录的dfrA17基因序列完全一致。EC菌广泛分布于自然界、健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下，EC 菌并不感染人体的任何组织，但当人体免疫力降低、长期大量使用广谱抗菌药 物或创伤性医疗操作等情况下易引起内源性感染。EC菌所致感染中以泌尿道感 染、呼吸道感染、菌血症等最常见。复方磺胺甲口恶喃为横胺甲基异口恶挫(sill fame thoxazole, SMZ)与甲氧 节胺嘧淀(trimethoprim, TMP)的复合制剂，磴胺的抑菌机制为与化学结构相似 的对氨苯甲酸(PABA)竞争二氢叶酸合成酶(DHPS),使二氢叶酸合成减少；甲氧 苄胺嘧啶能抑制二氢叶酸还原酶(DHFS)，使四氢叶酸的生成受阻。磺胺药与甲 氧苄胺嘧啶合用后，分别作用于细菌叶酸合成的不同环节，因而有协同作用1 。近年来，对细菌的可移动性遗传元件研究发现，I类整合子的耐药基因 盒中常携带二氢叶酸合成酶的编码基因sull，有些同时还携带二氢叶酸还原酶 的编码基因dfrA(早期文献中以dhfr表示)24。细菌额外获得sull基因， 所表达的二氢叶酸合成酶抵消了磺胺与PABA竞争性抑制作用，导致细菌耐磺胺。 细菌额外获得dfrA基因，所表达的二氢叶酸还原酶补充了甲氧苄胺嘧啶靶位酶， 导致细菌耐甲氧苄胺嘧啶。为了解EC菌复方磺胺甲口恶唑耐药相关基因存在状况，我们根据美国 GenBank核酸数据库中已发布的肠杆菌I类整合子基因序列，自行设计了 sull、 dfrAl、dfrA17基因PCR扩增引物。结果显示有40株检出sul和(或)dfrA基因 (66. 7%)，表型与基因型基本相符。对临床连续分离EC菌的复方磺胺甲口恶唑 (SMZ/TMP )耐药相关基因的专题研究国内为首次报道。1996年，在0139群霍乱弧菌中发现一种整合性接合元件，该元件整合于 细菌染色体上(长约lOOkbp)编码对磺胺甲基异口恶唑与甲氧节胺嘧啶的抗性， 被称为SH元件5。SH元件不仅存在于霍乱弧菌中，其它细菌内也有发现 6 。EC菌是否存在sn元件需要进一步研究。【参考文献】1汪复.抗菌药物作用机制和细菌耐药性M/闻玉梅主编.精编现代医学微生物学.上海：复旦大学出版社，2002: 306307.2 Le e J C, Oh J Y, Cho J W, et al. The prevalence oftrimethoprim resistance conferring dihydrofolate reductase genes in urinary isolates of Escherichia coli in Korea J . J Antimicrob Chemother, 2001,47(5):599604.3 Lindstedt B A, Heir E, Nygard I, et al. Characterization of class I integrons in clinical strains of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Typhimurium and Enteritidis from Norwegian hospitals J . J Med Microbiol,2003, 52 (Pt 2):141 149.4 Cabrera R, Ruiz J, Marco F, et al. Mechanism of resistance toseveral antimicrobial agents in Salmonella clinical isolates causing traveler' s diarrhea J. Antimicrob Agents5 Waldor M K, Tschape H, Mekalanos J J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae 0139 J . JBacteriol, 1996, 178(14): 41574165.6 Burrus V, Marrero J, Waldor M K. The current ICE age: Biology and evolution of SX1' related integrating conjugativc elements J Plasmid, 2006, 55(3): 173183.