牛大肠杆菌病灭活疫苗的制备及小鼠攻毒试验分析

牛大肠杆菌病灭活疫苗的制备及小鼠攻毒 试验分析作者：赫呜睿来源：现代畜牧科技2018年第10期摘要：近年来关于规模化牛场犊牛腹泻的报道日渐增多，大肠杆菌是引起犊牛腹泻最常见 的病原体。本研究对发病牛分离得到的大肠杆菌菌株进行生化试验、PCR鉴定、动物致病性试 验、细菌灭活、疫苗制备、小鼠免疫和攻毒保护试验。PCR结果表明大肠杆菌JS160810含有毒 力基因F41、Sta、K99，大肠杆菌ZD150808含有毒力基因irp2、FyuA、Stxl，动物致病性试验 结果表明都具有很强致病性。小鼠的最佳免疫剂量为CFU。攻毒保护结果氢氧化铝胶佐剂疫苗 的保护率为80%，说明疫苗能产生良好的免疫应答。为今后进行田间试验提供了理论依据，并 将为防治牛大肠杆菌病提供一种保护范围更加全面的生物制品。关键词：多价疫苗；犊牛；腹泻；强致病性；大肠杆菌病中图分类号：S855.1+2文献标识码：A文章编号：2095-9737(2018)10-0023-03犊牛腹泻常由于肠道内的细菌、病毒等病原微生物或者营养、环境等因素所致。其中致病 性大肠杆菌是犊牛腹泻发病的最主要因素之一。导致犊牛腹泻的大肠杆菌毒力因子主要有肠毒 素和菌毛黏附素等。犊牛大肠杆菌病有着较高的发病率及死亡率，而且还会继发感染其他疾病。 因为大肠杆菌拥有血清型众多、细菌变异性大、抗原复杂等特点，并且不同地区流行的血清型 菌株之间又存在着很大的差别。抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着积极作用，但是随着 抗生素的使用不当，大肠杆菌耐药谱和耐药水平不断提高，大肠杆菌多重耐药现象已十分严重。 如今新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的发展速度。外界环境对细菌 作出刺激后，细菌会大量产生毒力因子，这些因子的功能各不相同，在细菌致病的过程中起到 重要作用。目前，国内外先后出现了很多种相应预防犊牛腹泻的试验性疫苗，其中包含以抗黏 附素免疫为基础的含单价或多价黏附素抗原的灭活全菌苗、基因工程亚单位疫苗等。然而因为 大肠杆菌的血清型比较多，各地分离菌株携带的毒力因子及生物学特性又有所不同，使得疫苗 的应用受到很大限制，至今还没有普遍应用的预防犊牛大肠杆菌腹泻的商品化菌苗。因此，按 照不同地区致病性大肠杆菌的优势血清型研制出真正有效的灭活疫苗具有现实的生产意义。1材料大肠杆菌JS160810. ZD150808分别从齐齐哈尔市和肇东市某奶牛场发病犊牛分离并保存。试验动物为1822 g昆明系小鼠购自北京维通利华动物有限公司。蜂胶佐剂和氢氧化铝胶佐剂 由本实验室保存；革兰氏染色液购自安徽省巢湖市弘慈医疗器械有限公司；改良Minca肉汤、 营养琼脂、伊红美蓝凯琼脂等均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；生化试验管购自杭州 滨和微生物试剂有限公司。2方法将菌种材料分别在无菌环境下用细菌接种环接种于伊红美蓝培养基上再放置于37°C恒温箱 内培养24 h后观察结果。挑取伊红美蓝培养基上生长的单个菌落将细菌涂在载玻片上干燥后进 行革兰氏染色，并用显微镜进行镜检观察。分别挑取伊红美蓝培养基上各菌种的单个菌落接种 于改良Minca肉汤中放入37C空气浴摇床中进行细菌增殖培养16 h做疫苗菌液。2.2细菌生化鉴定无菌环境下使用接种环挑取各菌种单个菌落纯培养物分别接种到蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、 甘露糖、木糖、甘露醇、糊精、肌醇、葡萄糖、半乳糖、乳糖、山梨醇、果糖、明胶、葡萄糖 磷酸盐溶液、蛋白胨水等生化管中37C培养24 h后，观察结果并记录。2.3大肠杆菌毒力因子PCR鉴定煮沸法提取细菌DNA:取100 UL菌液于洁净的EP管中，再在管中加入100 uL磷酸盐缓 冲溶液(PBS)进行混合，将EP管至于高速离心机12000 r/min离心3 min，弃掉上清，按上述 步骤用PBS对菌液进行洗涤23次，洗涤后将EP管至于100C沸水中水浴20 min，12000 r/min离心15 min，吸上清于4C冰箱保存，作为模板DNA。靠 忙学巨闵思林.引构序列灿目的好国太小引物序刑b : L AT A LCI L ALU LbbL ALbG R/LALUCrriAGCAGL'AGlA'L'L'LC肉1t-=GAGGGAt-L11CATCLTLTAGK .ArH-nJCAITCWITTAT心F= TLAGACL"LCLrC AL：TCX：AAAa 电 TG L lG L A<XiA.AL CtX：CL CL G531iri-2K-AAGGALLCGC"LilTLLAi.t.UGAK /LCtSGCLAGGALGAL'LCLiTCG3CLbuAb AtAtXiGCr L A rCCLCTGCR.- iefcGGtLATCrTGA£ G A TL A JuL!C：AA95 iSilaL：yECCCCTirrTTACrLCAC；LVAJt： JL：部 凡马如愚 L IL163PCR反应体系：上游引物(10 uM)0.5uL、下游引物(10 uM)O.5uL、模板DNA luL、TaqMasterMix(5 u/uL)12.5 uL，补水至总体积为 25uL。反应程序:94C预变性 5 min;94C变性30 s，56C退火45 s，72C延伸1min，30个循环；72C终延伸5 min。反应结束后，PCR产物加入1%琼脂糖凝胶孔内，电泳仪调至135V，电泳槽通电25 min。取出凝胶用紫外凝胶成像系统观察并拍照保存。2.4大肠杆菌半数致死量(LDso)的测定夫楠询娥*1死量il J>L.S 妁褶定JS1为心,:?E部«吾械 阐iff卅加M，样受1, O：- 1b CPUZmLxl-. n k 1 dp C P C J/r* I - J. nx CFU/mLil. ox IV- <； V 1 FXrri I 、1,I 二 | 责 / F * r.k I . , 1 11J I I?* I nFT ；. r ii I . I , fl X IO" CFL <mL .1. O - 10? CFl ml. _ 1. O > I-O' CFU/ mJ.的 JW 嘛什倒巾唳注射小ih网K盐小的割M在鼾J* !. Rflt 4-IL .谴 I -ill , TiJ LO ! ! d » 电,I-J L 心.2 ml., fl n FI'Z圭屠永妙对 M 跑r在住ST片琼i I T A -1-向时 M -J ：<t小卫/ 我醯帆希将风蚂.x I Hnr I n Til |9j坤 ZTs I -.moH |湖jfl 中£削中阿浒波 i#行无rR '!都海檎的娉沽成为乩I八% .海rt <j甲fi¥的而诚 枚B时 M冷丫拍1早廉中府.岸"h由打混站一将玄f占后的华 槌什序I汪仲布时。料井珅岳略井逑审I改既 Fmm 族曲中. 混十卜林拎 m h版汽Mart依洒'&更.怕凫 *站精凿rtfli跛逃拧 辎外后"侦常箕化舟聪佐利网* 1琨仆,成人 5、或昂栩存.雎 平i H 曜陶 村(W :肴 S .x CFU/naL+将制备好的疫苗接种于伊红美蓝琼脂平板和改良Min-ca肉汤培养基中，37°C培养2天，观 察有无细菌生长。取10只小白鼠，分别皮下注射疫苗，0.5 mL/只；观察10天，记录食欲及精 神状态。ZP7 星佳克漕祸圣逸雄点攻瘁株粽试验本军肘碍并瑚四组澄行免痕,分削是Gru叩H免痕的可 3<CX1 如决"Ge铲免度到扯J?.flX10a CFUF耕 Group取兔控割址 1玮X N* CFU/ R北京母化础佐副的 股组心蝴1 1川.山 南沮虬日小自鼠叫升冏膳小白 找-吴用战 ' 去三注切，艮生技1农、免TEMIffllMM为打夭一 Gr'jup I .t.Ti j Ji； EGrqup c .Coj 顾句宿忏取:.口小鼠进打 府新分坦，步成讨个典督组每如W H小鼠，用W 乂 LC虹酒蔺 浪EDI初如3切混 H知括炯渔JSL6nSQ时间关改写徂分 做站，攻肖酎间为=次毋柱结裒片魅3大，食雀弱卖7 £冉小鼠的&磨艮殊亡情况一3结果与分析3.1疫苗的无菌及安全性检验结果结果均无任何微生物生长。小鼠接种10天后全部健康存活，注射氢氧化铝胶佐剂疫苗的小 鼠注射部位皮肤上有肿块，无化脓现象。3.2细菌镜检结果细菌为两端钝圆的革兰氏阴性短小杆菌，个别菌体可呈近似椭圆形，多单独或成对存在， 不形成芽胞符合大肠杆菌形态特异性3.3生化试验结果这两株菌均符合大肠杆菌的生化特性，具体结果见表2。州MKim俯机mn棚般 &«1 r N H H H i Bi 1 H t! 13.4 PCR检测结果JS160810大肠杆菌F41、Sta、K99基因分别在431 bp、314 bp、163 bp处有清晰条带， 与预期目的片段大小相符，见图1。ZD150808大肠杆菌irp2、fyuA、Stxl基因分别在953bp、 531 bp、301 bp处有清晰条带，与预期目的片段大小相符，见图2，1-炸HJ浦心卜L.知上. llSiPG屯*期W?UL ：映亦"W瞰:R2 Hflf的5fiS诉时汨i isKkat3.5大肠杆菌半数致死量检测结果大肠杆菌 JS160810 的 LDso 为 1.78Xlos CFU,大肠杆菌 ZD150808 的 LDso 为 2.51Xlos CFU。3.6最佳免疫剂量确定及攻毒保护试验结果以大肠杆菌JS160810攻毒后，Group 1在7天内死亡6只小鼠Group 2在7天内死亡4只 小鼠Group 3在7天内死亡2只小鼠，以大肠杆菌ZD150808攻毒后，Group 1在7天内死亡7 只小鼠，Group 2在7天内死亡6只小鼠Group 3在7天内死亡2只小鼠，Group 3中小鼠存活 率都很高，且保护率均为80%。堆*衅我该病一年四季均可发生，犊牛和羔羊多发于冬、春舍饲期间。一旦发生，病死率很高，有 的甚至能够达到100% ；牛、羊发病时一般呈散发性或地方流行性。大肠杆菌肠毒素的类型分为 耐热型肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)两类，将它们制成双联苗后，可以抵抗各类产肠毒素性 大肠杆菌(ETEC)感染。一般来说，动物源性的ETEC菌株只产生ST。据调查，引起犊牛、羔羊 腹泻的ETEC黏附素中K99和F41相加占50%以上。本试验利用从黑龙江省部分市区腹泻犊牛的 病料中分离、筛选出的2株致病性大肠杆菌菌株，研制出牛大肠杆菌病灭活苗，病料采集范围 广泛，涵盖黑龙江地区各主要规模化养牛场，分离的菌株具有一定的代表性和普遍性，这些都 为针对地区流行的牛大肠杆菌病疫苗的研制奠定了良好基础，经动物实验证明研制出的地方株 大肠杆菌病灭活苗具备较好的保护效果。研究表明，改良Minca肉汤培养的抗原所制备的免疫 血清效价高，抗体维持时间长。这是由于液体培养条件下菌株的各种生物学性状得到充分表达。 因此，本试验采用了液体培养法对疫苗抗原进行培养。要全面有效地控制大肠杆菌病，在采用 疫苗免疫的同时还应采取综合性防治措施，加强饲养管理，提高犊牛抗体水平和减少应激等。