槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定

实验二 槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的未开放花蕾。味 苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、 痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达1216%，其次含有 槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁 具有Vitp样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作 毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。目的要求1 .通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理 及操作。2. 掌握槲皮素的制备原理及操作。3. 熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用4. 通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 实验原理芦丁（rutin）： C27H30O16 -3H2O,浅黄色针状结晶，mp174178°C （含三分子水）；188C（无水物）。难溶于冷水（1： 800010000）， 可溶于热水（1： 180200），热甲醇（1： 10），冷甲醇（1： 100）， 热乙醇（1： 60），冷乙醇（1： 650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油 醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。槲皮素（quercetin）： C15H10O7 *2H2O,黄色结晶，mp313314C （2分子结晶水），316C（无水物）。能溶于冷乙醇（1： 290），易 溶于沸乙醇（1： 23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、毗啶、丙 酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。HO+鼠李糖+葡萄糖芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中， 在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、 热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦 丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。 通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。实验内容一、芦丁的提取分离及精制方法槐米粗粉（50g）置1000ml烧杯中，加入500ml饱和石灰水，加热，并维持pH89 煮沸20分钟，趁热用脱脂棉滤过滤液药渣I用300ml饱和石灰水煮沸10分钟，维持pH89趁热滤过滤液药渣（X）合并 I在60°C70°C下用浓HCl调pH至45静置，抽滤T沉淀1低温（80C）干燥，称重。按1： 200的比例加水，加热使溶解，趁热滤过滤液静置，抽滤，减压干燥，计算收率芦丁精制品方法 利用芦丁在冷热溶剂中的溶解度不同进行提取分离。槐米粗粉沸水煮沸510分钟，反复2次趁热滤过水提取液药渣放冷沉淀析出（粗芦丁）I热水重结晶或乙醇重结晶芦丁结晶二、槲皮素的制备称取精品芦丁 1g置250ml烧瓶中加 2%H2SO4200ml加热回流1小时放冷，静置，抽滤酸性滤液中和中性滤液浓缩浓缩液沉淀1水洗两次，干燥乙醇重结晶称重，计算收率黄色细针状结晶（槲皮素）（供糖的PC鉴定）三、检识反应1. 芦丁的定性反应取芦丁适量，加乙醇使溶解，分成三份供下述试验用：（1）盐酸镁粉试验：取样品液适量，加2滴浓HCl、再酌加少许 镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。（2）锆-枸试验：取样品液适量，然后加2%ZrOCl2的甲醇溶液， 注意观察颜色变化，再加入2%枸椽酸的甲醇溶液，并详细记录颜色 变化。(3)a -萘酚-浓硫酸反应：取样品液适量，加等体积的l0%a -萘 酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。2.芦丁的UV(1)鉴定试剂的配制 甲醇钠溶液：取0.25g金属钠，切碎，小心加入色谱甲醇 10ml中，此液置于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。 三氯化铝溶液：取1g无水三氯化铝，小心加入色谱甲醇 20ml中，放置24小时后全部溶解即得。 醋酸钠：用无水粉末醋酸钠。硼酸饱和溶液：取无水硼酸，加入适量色谱甲醇、制成饱 和溶液。(上述贮备液可放置六个月)(2) 芦丁溶液的配制精密称取芦丁纯品0.5g，用甲醇适量溶解至50ml容量瓶中，用 甲醇稀释至刻度。(3) 光谱的测定 甲醇光谱：取样品液置石英杯中，至200500nm内进行 扫描，重复一次，观察紫外光谱。 甲醇钠光谱:取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液3滴后， 立即测定，放置5分钟后再测一次。 三氯化铝光谱，在盛有样品液的石英杯中，加入三氯化铝6 滴，放置1分钟后进行测定。测定后加入3滴盐酸溶液(盐酸：水= 1： 1)再进行测定。 醋酸钠光谱：取样品液约3ml，加入过量的无水醋酸钠固体， 摇匀(杯底剩有约2mg的醋酸钠)，加入醋酸钠后两分钟内测定，5 分钟到10分钟后再测定一次。3. 芦丁及槲皮素的色谱支持剂：中速层析滤液（5X20cm）展开剂：正丁醇-醋酸-水（4： 1： 5）上层样品：自制槲皮素的乙醇溶液自制芦丁的乙醇溶液对照品：槲皮素标准品的乙醇溶液芦丁标准品的乙醇溶液显色剂：三氯化铝乙醇溶液喷雾4. 糖的纸色谱检识支持剂：中速层析滤纸（5X20cm）样品：取水解后的滤液10ml，水浴加热，且在搅拌下加适量碳 酸钡细粉至PH中性，过滤，取滤液并浓缩至2mI左右， 放冷后，供纸色谱点样用。对照品：1 %葡萄糖标准品醇溶液及1 %鼠李糖标准品醇溶液 展开剂：正丁醇-醋酸-水（4： 1： 5）上层显色剂：喷以邻苯二甲酸苯胺溶液，105°C烘烤5分钟至斑点 显色清晰。实验说明及注意事项1. 用石灰水调节芦丁提取溶液的PH，既可以达到碱提取芦丁 的目的，还可以除去槐米中含有的大量粘液质。但钙离子浓度及pH 值均不宜过高，否则多余的钙能与芦丁形成螯合物沉淀，同时黄酮母 核在强碱性条件下易被破坏。2. 用HCl调PH时，应注意PH不要过低，因为PH过低（PH2 以下）会使芦丁形成铮 盐而使已形成的沉淀重新溶解，同时黄酮母 核也会在强碱性条件下被破坏，导致收率下降。3 .注意观察槲皮素制备过程中的实验现象。思考题1. 苷类结构检识的一般程序？2. 苷类水解有几种催化方法？3. 怎样确定芦丁结构中糖基是否联结在槲皮素3-O位上?4. 怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖？5. UV在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。